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【静静菌】我的 WB 经验分享,快来帮我点赞吧!

相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

最新修订时间:

用途

检测目标蛋白含量变化

材料与仪器

浓缩胶、分离胶、基层胶、细胞裂解液等

步骤

1.分别配制 5% 浓缩胶和 12% 分离胶

12% 分离胶10mL 5%积层胶 6mL
H2O 3.3mL H2O 4.20mL
30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mL
pH8.8 Tris HCl(1.5M) 2.5mL PH6.8Tris HCl(1M) 0.76mL
10%APS 100uL 10%APS 60uL
10%SDS 100uL 10%SDS 60uL
TEMED 7.6uL TEMED 6uL

分离胶:分离胶配制完毕即可进行灌胶,灌胶结束后使用 ddH2O 进行液封。当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已经凝好。(一般要等 1.5h)

积层胶:倒掉分离胶上层的水并用吸水纸吸干,配制积层胶并进行灌胶,插入梳子。积层胶凝固完全后拔掉梳子,准备上样电泳。(一般凝固 0.5h 以上)

2.电泳
上样顺序如下:
细胞裂解液 15ul 细胞裂解液 15ul 预染蛋白 Marker 10uL 细胞裂解液 15ul 细胞裂解液 15ul
电泳条件:90V 1.5h 。

3.转印:
电泳结束后,取出胶,剪相应大小的一张硝酸纤维素膜和六张滤纸,将胶、膜、滤纸和海绵放入转印缓冲液中浸透,取夹子,按照“海绵—三层滤纸—胶—硝酸纤维素膜—三层滤纸—海绵”的顺序安装好,每一步都要避免产生气泡,放入转印装置中,使胶靠近负极,膜靠近正极。
转印条件:90 mA, 90 min。

4.封闭:
膜片置于封闭液(PBS / 5%脱脂奶粉)中,4℃ 过夜封闭。
取出膜 PBST 洗三次,每次洗 5 min。

5.一抗孵育:
稀释液为 1% 的PBS脱脂奶粉
一抗(鼠抗)稀释 500 倍(说明书上为 500-1000 倍)。70r/min,室温孵育 3h。
PBST 洗 3 次,每次 8 min。

6.二抗孵育:
稀释液为 1% 的 PBS 脱脂奶粉
使用 AP 标记的羊抗小鼠的二抗,稀释约 30000 倍。70r/min,室温孵育 2 h。
PBST 洗 3 次,每次 8 min。

7.显色
按照以下配方配制 NBT/BCIP 显色液:
NBT 原液:NBT 40mg 加 0.7% 的 DMF 1.2mL 混匀,4℃ 避光保存(用铝箔包裹);
对照、待测 NBT,各配一组。
BCIP 原液:BCIP 20mg 加 100% 的 DMF 1.2mL 混匀,4℃ 避光保存(用铝箔包裹)。
显色缓冲液:0.1M Tris HCl ,0.1M NaCl ,50mM MgCl2,pH 9. 5。

使用时 BCIP 和 NBT 各 10uL 加在 1mL 缓冲液中,EP 管中混匀,滴到膜上,避光处显色,5~10 分钟。见条带后,水洗,中止显色。

如果是 DAB 显示的话,其他步骤一样,就是最后一步显示,按照 DAB 显示试剂盒要求操作就可以了。

注意事项

注意如条带两边扩散,可能是加样量过多,建议适当减少上样量。

常见问题

问题1:电泳条带成笑脸状。
答案:胶不均匀冷切,中间冷却不好,电泳系统温度偏高。建议减少电压减慢电泳速度,在冷室或者冰浴中进行电泳。

问题2:电泳条带成皱眉状。
答案:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全,建议调整装置。

问题3:拖尾。
答案:样品溶解不好,建议样品充分溶解混匀后上样。

来源:丁香实验

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