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检测目标蛋白含量变化

浓缩胶、分离胶、基层胶、细胞裂解液等

1.分别配制 5% 浓缩胶和 12% 分离胶

12% 分离胶10mL 5%积层胶 6mL
H2O 3.3mL H2O 4.20mL
30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mL
pH8.8 Tris HCl（1.5M） 2.5mL PH6.8Tris HCl（1M） 0.76mL
10%APS 100uL 10%APS 60uL
10%SDS 100uL 10%SDS 60uL
TEMED 7.6uL TEMED 6uL

分离胶：分离胶配制完毕即可进行灌胶，灌胶结束后使用 ddH2O 进行液封。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝好。（一般要等 1.5h）

积层胶：倒掉分离胶上层的水并用吸水纸吸干，配制积层胶并进行灌胶，插入梳子。积层胶凝固完全后拔掉梳子，准备上样电泳。（一般凝固 0.5h 以上）

2.电泳
上样顺序如下：
细胞裂解液 15ul 细胞裂解液 15ul 预染蛋白 Marker 10uL 细胞裂解液 15ul 细胞裂解液 15ul
电泳条件：90V 1.5h 。

3.转印：
电泳结束后，取出胶，剪相应大小的一张硝酸纤维素膜和六张滤纸，将胶、膜、滤纸和海绵放入转印缓冲液中浸透，取夹子，按照“海绵—三层滤纸—胶—硝酸纤维素膜—三层滤纸—海绵”的顺序安装好，每一步都要避免产生气泡，放入转印装置中，使胶靠近负极，膜靠近正极。
转印条件：90 mA， 90 min。

4.封闭：
膜片置于封闭液（PBS / 5%脱脂奶粉）中，4℃ 过夜封闭。
取出膜 PBST 洗三次，每次洗 5 min。

5.一抗孵育：
稀释液为 1% 的PBS脱脂奶粉
一抗（鼠抗）稀释 500 倍（说明书上为 500-1000 倍）。70r/min，室温孵育 3h。
PBST 洗 3 次，每次 8 min。

6.二抗孵育：
稀释液为 1% 的 PBS 脱脂奶粉
使用 AP 标记的羊抗小鼠的二抗，稀释约 30000 倍。70r/min，室温孵育 2 h。
PBST 洗 3 次，每次 8 min。

7.显色
按照以下配方配制 NBT/BCIP 显色液：
NBT 原液：NBT 40mg 加 0.7％ 的 DMF 1.2mL 混匀，4℃ 避光保存(用铝箔包裹)；
对照、待测 NBT，各配一组。
BCIP 原液：BCIP 20mg 加 100％ 的 DMF 1.2mL 混匀，4℃ 避光保存(用铝箔包裹)。
显色缓冲液：0.1M Tris HCl ，0.1M NaCl ，50mM MgCl2，pH 9. 5。

使用时 BCIP 和 NBT 各 10uL 加在 1mL 缓冲液中，EP 管中混匀，滴到膜上，避光处显色，5~10 分钟。见条带后，水洗，中止显色。

如果是 DAB 显示的话，其他步骤一样，就是最后一步显示，按照 DAB 显示试剂盒要求操作就可以了。

注意如条带两边扩散，可能是加样量过多，建议适当减少上样量。

问题1:电泳条带成笑脸状。
答案：胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高。建议减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳。

问题2:电泳条带成皱眉状。
答案：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全，建议调整装置。

问题3:拖尾。
答案：样品溶解不好，建议样品充分溶解混匀后上样。