Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:

一、原理

二、分类

i.放射自显影

ii.底物化学发光ECL

iii.底物荧光ECF

iv.底物DAB呈色

三、主要试剂

四、主要步骤

五、实验常见的问题指南

1.参考书推荐

2.针对样品的常见问题

3.抗体

4.滤纸、胶和膜的问题

5.Marker的相关疑问

6.染色的选择

7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题

9.条件的摸索

10.方法的介绍

11.结果分析

一、原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 ，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳 分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳 分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

三、主要试剂

1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤40℃存。

4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤40℃存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.

6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25μl，总蛋白量100μg。

7、Tris-甘氨酸电泳 缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。

8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。

9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。

10、脱脂奶粉5%(w/v)。

11、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。

13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

14、过氧化物酶标记的第二抗体。

15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。

18、100mmol/L NaCl。

19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。

（可以参看分子克隆）

四、主要步骤

生物秀为您搜集了现阶段几乎网上所有的Western Blot的中英文资料，仅供实验参考，可以根据自己实验的实际情况进行调整：

Western Blot PROTOCOL：

五、实验常见的问题指南

根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：

1.参考书推荐

A.对初学者看什么资料比较好？

解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。

2.针对样品的常见问题

B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

E.同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？

解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

F.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？

解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？

解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10%甲醇。

H.想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳 的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？

解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6%，Stacking Gel 3.5%。

I.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。

解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb。

J.蛋白变性后可以存放多久？

解答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

K.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方，不知为何？

解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

L.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5%的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

M.还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。