【求助】小抽质粒浓度很低
丁香园论坛
19651
本人最近小提质粒，挑取单克隆于3毫升LB培养基培养6小时候抽质粒，发现浓度只有50纳克每微升。
后来重新挑取单克隆于10毫升LB培养基培养14小时，收集10ml菌液进行离心，裂解，上柱（10ml菌液只上一个柱子，量绝对足够了吧），结果浓度才300纳克每微升，我本计划下步做转染，如此低得浓度我很是担心啊
不知道大家有没有遇到过此情况。我用的是pEGFP-N2质粒，是高拷贝的。
PS：我怀疑是不是抗生素失效导致杂菌污染，如果抽得质粒全是杂菌的话，测得浓度和OD值会不会和正常的质粒不一样呢？
后来重新挑取单克隆于10毫升LB培养基培养14小时，收集10ml菌液进行离心，裂解，上柱（10ml菌液只上一个柱子，量绝对足够了吧），结果浓度才300纳克每微升，我本计划下步做转染，如此低得浓度我很是担心啊
不知道大家有没有遇到过此情况。我用的是pEGFP-N2质粒，是高拷贝的。
PS：我怀疑是不是抗生素失效导致杂菌污染，如果抽得质粒全是杂菌的话，测得浓度和OD值会不会和正常的质粒不一样呢？
4小时能提出50ng已经不错了，10毫升菌液杂质也会相应增加，内毒素会影响转染效率的。
LB摇菌对质粒小抽来说不太适合，建议用TB或SB加2mM MgSO4, 2-5毫升菌液保证供氧充分，摇24小时后加170ug/L氯霉素再摇2小时就能抽出微克浓度的质粒了。不知道你做什么样的转染，如果用量大的话完全可以做大抽。
卡那霉素用量建议50ug/mL, 如果在TB这样含磷酸盐的培养基上必须再加到100ug/mL
LB摇菌对质粒小抽来说不太适合，建议用TB或SB加2mM MgSO4, 2-5毫升菌液保证供氧充分，摇24小时后加170ug/L氯霉素再摇2小时就能抽出微克浓度的质粒了。不知道你做什么样的转染，如果用量大的话完全可以做大抽。
卡那霉素用量建议50ug/mL, 如果在TB这样含磷酸盐的培养基上必须再加到100ug/mL
请问，解决了吗，我也遇到了这个问题，很苦恼啊。。
313043636
请问，解决了吗，我也遇到了这个问题，很苦恼啊。。
提高抗生素浓度！
用天根的中抽kit
你3毫升才摇4小时，肯定浓度太低了，细菌都没长多少。一般都得12到16小时。
shylook wrote:
提高抗生素浓度！
用天根的中抽kit
请问一般提高抗生素浓度到多大能较好的提高质粒得浓度呢？
紫藤花笨笨熊
请问一般提高抗生素浓度到多大能较好的提高质粒得浓度呢？
amp我平时用100mg/L
上到150 没问题
你这低拷贝？
我的载体是pires2-egfp这个貌似是低拷贝的，自己也不大懂。载体抗性是卡那，我用的浓度是30ug/ml。这次摇的目的过表达的浓度才80ng/ul.做不了转染了。不知道提出来的质粒可以重新转化不？还是提高抗生素浓度，再摇菌……
紫藤花笨笨熊
我的载体是pires2-egfp这个貌似是低拷贝的，自己也不大懂。载体抗性是卡那，我用的浓度是30ug/ml。这次摇的目的过表达的浓度才80ng/ul.做不了转染了。不知道提出来的质粒可以重新转化不？还是提高抗生素浓度，再摇菌……
提高到50ug/ml试试
不行就换大抽 天根
shylook wrote:
提高到50ug/ml试试
不行就换大抽 天根
哦 好的 我试试先提高抗生素浓度 现在我用的是omega小提的
紫藤花笨笨熊
哦 好的 我试试先提高抗生素浓度 现在我用的是omega小提的
建议你用天根的小提中量！
我不是天根的托
shylook wrote:
不合算
建议你用天根的小提中量！
我不是天根的托[/quote
嗯嗯 我相信你 也很感谢你的指导。有问题再向你请教。
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