已经测序正确的菌液，再提质粒时发现酶切验证切不开，酶活性没问题。酶切位点之前也是切过得。是什么原因呢

是不是操作有误啊？还有，已经测序正确了为什么还要酶切验证？如果是单酶切的话切没切开可能差距不大，看不出来有没有切开。

可能是在提质粒过程中发生了基因重组。

可能是由于加的限制性内切酶的量不够。或者酶切的时间不充足。

可能是测序正确的菌液在扩增过程中被污染了，可以再PCR验证一下目的片段还在不在。

怀疑菌液中质粒丢失或污染了。可再送一次测序

有没有可能是酶或者buffer出现问题了？

可能原因：

1.反应体系不合适；

2.底物不对，出现甲基化等：

3.酶活性丢失。