【交流】载体构建时酶切位点选择及引物设计的相关问题

我想把目的基因连接到载体上，有几个问题想请教斑竹和各位战友：

1、限制性内切酶的选择：我查看论坛说选择酶切位点需要考虑酶切位点在载体上的距离、酶切温度与连接效率、价格、使用频率等等。最后我综合价格、温度、Buffer选定XbaI和EcoRI，打算购买宝生的酶，相应的Buffer用附带的10×M Buffer。不知道我选择的酶切位点合适不合适呢？

2、引物设计：引物结构为：保护碱基＋酶切位点＋目的基因末端

上游引物5’－CCG TCTAGA ATGGCTTCGTACCCCTGC-3'

下游引物5’－CCC GAATTC TCAGTTAGCCTCCCCCAT -3'

不知道我这个引物设计得合不合理呢？

我还有疑问到底要不要去除终止子TGA啊？如果不去除对后面的copGFP表达有没有影响？如果要去除，对读码框的影响要不要考虑？ 我设计引物的时候没有去除终止密码子TGA，因为在copGFP前面还有一个EF1启动子驱动copGFP的表达，不知道我这样考虑对不对？


附：