【交流】说说我的载体构建经历
丁香园论坛
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目的:构建目的基因的真核表达载体 历时整整一学期,期间经历了很多挫折,遇到很多问题,也从中学到很多经验.借寒假的时间写了写我一学期构建的经历,把我的一点经验拿出来和大家分享讨论.
分步来说:
一.PCR扩增得到目的片段
1.引物的设计与合成:
这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基） ，后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次送了五个克隆测序，三个是上游引物出错，两个是正确的克隆，60％的出错率。
现在想想，有几点教训：
(1)尽量避免长引物的合成。越长意味着出错的几率越大，哪家公司都这样
(2)选择一家质量可靠的公司，千万别在这省钱，引物再贵也花不了多少钱，可一轮构建下来，一测序发现引物错了，不知白扔了多少钱不说，那种心情实在是难以收拾
（3）一旦发现引物有问题，及时换公司，我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过，结果还是错，时间咱耽误不起
2.Pfu酶扩增：
（1）扩增效率低的问题：
往往taq酶扩的很好，一换成pfu就是扩不出来。解决办法：a延长延伸时间(我1.2kb用3分15秒才扩出来)，并适当增加循环数;b多试几家的pfu，总有一家能扩出来;c多设计几对引物试试，总有一对能扩出来，因为pfu有外切活性，可否适当的延长引物的3’互补端；d构建中间载体：一旦用某一对引物能扩出来，把此目的片段连接t－easy中间载体，测序正确后，即可以此中间载体做pcr扩增的模板。实践证明以此中间载体为模板的pfu扩增效率远远高于以cDNA为模板。
（2）pfu保真性的问题：
即使是pfu，也会出错。现在各家公司都有号称高保真的pfu酶出售，价格不一。虽然都是pfu，但质量不不见得一样，在都能扩增出来的情况下，选择信誉好的公司的pfu。我用的是一家小公司的pfu，很便宜，100u才80块钱，但我1.2kb的片段却频频出错。所以万不可在酶上省那百十块钱，最后花了大钱不说，还浪费了时间精力。
3．cDNA模板的问题：
在pfu摸条件这一步往往要耗费大量cDNA模板,因此在开始要准备足够的cDNA。100ul，200ul都不为过。新提取的RNA证明很好的话，就再多逆转录几管，我的RNA在－80℃放了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。当然这其中可能有很多原因，酶的问题，RNA的降解等等，但是当你做PCR做到很烦的时候，发现cDNA模板不够了，又重新养细胞提RNA是一件非常痛苦的事情。
二．酶切的问题：
用于构建的酶切一定要非常充分！
新买回来的酶要分装，用于“酶切后回收”和“酶切鉴定”的酶要分开。因为用于“酶切鉴定”时，只要能切出来就行了，而用于“酶切后回收再做连接”的酶一定要保证切的充分，才能提高连接效率，更重要的是减少筛选时的麻烦！我有一段时间连挑了三十多个克隆都是空载体，当然一方面怪我没有做载体自连的阴性对照，及时发现这一问题，另一方面酶反复从冰箱拿出来活性下降酶切效率降低，导致大量的载体自身连接。我觉得内切酶这东西还是挺娇气的，所以还是建议大家新酶分装，用于“酶切鉴定”的可稍放松，用于“酶切后回收”的酶一定要尽量减少冻融次数，并尽量减少在室温放置的时间。
三．PCR产物直接酶切：
我设计引物时保护碱基时随意的在酶切位点两侧加上了两三个g或者c的组合，做到后来才知道加保护碱基也是有说法的，不同的保护碱基会影响酶切的效率。以我随意加上的保护碱基，理论上酶切效率将极低。但做下来，前后酶切了四条不同的PCR产物，我并没有再这一步上遇到问题，我一般37℃切30到35个小时，酶切效率都不错。可见关于保护碱基的问题并不是那么绝对。
四．连接：
再这一步上我最深刻的教训就是关于做对照的问题。
第一次酶切的载体做载体自连的阴性对照，仅长出了几个克隆。为了省事，以后都省去了这一步。有两周，我连续做了两轮酶切连接筛选，总共挑了三十多个克隆，居然全是空载体！这时再补一个载体自连对照，满板子都是菌落。再换两支新酶重新切载体，回收后再自连，板子上仅有几个菌落。为了省一点小事费了大力气，后悔莫及。从此以后，认认真真做对照。
另外，关于连接，我是用电泳的方法大概确定载体和目的片段浓度，然后一1：5－8左右的比例配连接体系，感觉还不错。
五．粗筛：
有很多种方法，我主要用过两种：碱裂解粗提质粒后酶切，费时费力，但准确性高;PCR，简单省事，但易出现假阳性。
相比之下，我更倾向于PCR。操作过程中小心一点，尽量避免各克隆之间的污染，我还习惯于加厚厚一层石蜡油，一般的我还没有遇到假阳性的情况。
一个简单载体的构建，我花了整整一学期的时间。做科研的路充满了挑战，考验和艰辛。遇到问题的时候，和老师师兄师姐同学讨论，到论坛上来查以前的帖子，受益匪浅。谢谢论坛上的前辈们。把我的一点经验拿出来和大家分享，肯定也有很多不准确不完善的地方。仅供参考也欢迎讨论
分步来说:
一.PCR扩增得到目的片段
1.引物的设计与合成:
这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基） ，后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次送了五个克隆测序，三个是上游引物出错，两个是正确的克隆，60％的出错率。
现在想想，有几点教训：
(1)尽量避免长引物的合成。越长意味着出错的几率越大，哪家公司都这样
(2)选择一家质量可靠的公司，千万别在这省钱，引物再贵也花不了多少钱，可一轮构建下来，一测序发现引物错了，不知白扔了多少钱不说，那种心情实在是难以收拾
（3）一旦发现引物有问题，及时换公司，我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过，结果还是错，时间咱耽误不起
2.Pfu酶扩增：
（1）扩增效率低的问题：
往往taq酶扩的很好，一换成pfu就是扩不出来。解决办法：a延长延伸时间(我1.2kb用3分15秒才扩出来)，并适当增加循环数;b多试几家的pfu，总有一家能扩出来;c多设计几对引物试试，总有一对能扩出来，因为pfu有外切活性，可否适当的延长引物的3’互补端；d构建中间载体：一旦用某一对引物能扩出来，把此目的片段连接t－easy中间载体，测序正确后，即可以此中间载体做pcr扩增的模板。实践证明以此中间载体为模板的pfu扩增效率远远高于以cDNA为模板。
（2）pfu保真性的问题：
即使是pfu，也会出错。现在各家公司都有号称高保真的pfu酶出售，价格不一。虽然都是pfu，但质量不不见得一样，在都能扩增出来的情况下，选择信誉好的公司的pfu。我用的是一家小公司的pfu，很便宜，100u才80块钱，但我1.2kb的片段却频频出错。所以万不可在酶上省那百十块钱，最后花了大钱不说，还浪费了时间精力。
3．cDNA模板的问题：
在pfu摸条件这一步往往要耗费大量cDNA模板,因此在开始要准备足够的cDNA。100ul，200ul都不为过。新提取的RNA证明很好的话，就再多逆转录几管，我的RNA在－80℃放了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。当然这其中可能有很多原因，酶的问题，RNA的降解等等，但是当你做PCR做到很烦的时候，发现cDNA模板不够了，又重新养细胞提RNA是一件非常痛苦的事情。
二．酶切的问题：
用于构建的酶切一定要非常充分！
新买回来的酶要分装，用于“酶切后回收”和“酶切鉴定”的酶要分开。因为用于“酶切鉴定”时，只要能切出来就行了，而用于“酶切后回收再做连接”的酶一定要保证切的充分，才能提高连接效率，更重要的是减少筛选时的麻烦！我有一段时间连挑了三十多个克隆都是空载体，当然一方面怪我没有做载体自连的阴性对照，及时发现这一问题，另一方面酶反复从冰箱拿出来活性下降酶切效率降低，导致大量的载体自身连接。我觉得内切酶这东西还是挺娇气的，所以还是建议大家新酶分装，用于“酶切鉴定”的可稍放松，用于“酶切后回收”的酶一定要尽量减少冻融次数，并尽量减少在室温放置的时间。
三．PCR产物直接酶切：
我设计引物时保护碱基时随意的在酶切位点两侧加上了两三个g或者c的组合，做到后来才知道加保护碱基也是有说法的，不同的保护碱基会影响酶切的效率。以我随意加上的保护碱基，理论上酶切效率将极低。但做下来，前后酶切了四条不同的PCR产物，我并没有再这一步上遇到问题，我一般37℃切30到35个小时，酶切效率都不错。可见关于保护碱基的问题并不是那么绝对。
四．连接：
再这一步上我最深刻的教训就是关于做对照的问题。
第一次酶切的载体做载体自连的阴性对照，仅长出了几个克隆。为了省事，以后都省去了这一步。有两周，我连续做了两轮酶切连接筛选，总共挑了三十多个克隆，居然全是空载体！这时再补一个载体自连对照，满板子都是菌落。再换两支新酶重新切载体，回收后再自连，板子上仅有几个菌落。为了省一点小事费了大力气，后悔莫及。从此以后，认认真真做对照。
另外，关于连接，我是用电泳的方法大概确定载体和目的片段浓度，然后一1：5－8左右的比例配连接体系，感觉还不错。
五．粗筛：
有很多种方法，我主要用过两种：碱裂解粗提质粒后酶切，费时费力，但准确性高;PCR，简单省事，但易出现假阳性。
相比之下，我更倾向于PCR。操作过程中小心一点，尽量避免各克隆之间的污染，我还习惯于加厚厚一层石蜡油，一般的我还没有遇到假阳性的情况。
一个简单载体的构建，我花了整整一学期的时间。做科研的路充满了挑战，考验和艰辛。遇到问题的时候，和老师师兄师姐同学讨论，到论坛上来查以前的帖子，受益匪浅。谢谢论坛上的前辈们。把我的一点经验拿出来和大家分享，肯定也有很多不准确不完善的地方。仅供参考也欢迎讨论
