【交流】载体构建的心得

我以前做过比较多的载体构建，从来没遇到困难，因此想当然的认为这是太简单的事情，最近克隆一个基因就遇到了很多问题，花了1个月时间才成功，所以把我的经验和大家分享一下：我的目的基因是5kb左右的，因此刚开始用的是Takara的普通的premix exTaq，后来看说明说这个酶可以扩增3.7kb的产物，但Takara的网站上又说可以扩增10kb长度的产物，刚开始一直未成功，从PCR阶段就出问题了，没有目的片段，只有2kb的片段，很纳闷，不管怎么样换cDNA模板都不行，后面仔细观察凝胶，发现目的5kb处隐约有一点点片段，我就想，会不会是退火温度的问题，因我用的是55度，然后我设了58度，61度及65度的梯度，结果58度有两条带，61度有目的条带，65度什么也没有，遂确定61度为退火温度。然后就想，LA taq应该更保险，于是又临时订了1支，PCR跑出来很完美，效率也很高，但克隆却一直不成功。我用的是NotI和SalI这两个酶，我的载体因为这两个位点在一起，因此载体是分两步切。后来我就想，可能是SalI连接效率的问题，因为T4连接酶连SalI的切口只有一般酶的40分之一，于是我又重新设计引物，只用NotI一个酶，上下游都引入这个位点，单酶切就可以搞定，载体需使用CIAP去磷酸化防止自身环化。但是由于插入片段的正反方向问题，需用KpnI酶切鉴定（载体和目的片段中有该位点，正向序列会有1.9kb条带，反向则有2.5kb条带）。结果平板上长出菌落大大增多，我很高兴，应该差不多成功了，但是结果却仍然没有，还是原质粒，没有基因插入，后来我又仔细观察平板，其实上面长有不同规格的菌落，我挑的都是饱满的大菌落，刚开始以为小的菌落（只有大菌落的1/4大小）是杂菌，我就想，会不会由于重组的质粒比原质粒大5kb（12.5kb大，原质粒为7.5kb），再又由于重组质粒去磷酸化后的连接会有gap需要在细菌内将缺口补齐才能扩增，因此长出的菌落会小点，于是我很兴奋，为了证实我的猜想，我挑了10个很小的菌落，重抽质粒KpnI单酶切，很开心，猜想完全正确，而且有8个质粒正确，2个是反向插入的，目前正在测序中。
总结：
1.两个酶切位点很近时要尽量避免，可以使用单酶切，质粒再去磷酸化，其实也很方便
2.目的片段很大时在细菌内的扩增可能会很慢，菌落会较正常菌落要小
3.去磷酸化后连接的重组质粒的菌落也有可能比正常菌落要小
4.总是失败时一定要从PCR开始着手改正，我的第二次引物我就在NotI前加了3个保护碱基（Takara网站上说2个就可以），以确保能切开
个人的经验，希望对大家有参考价值。