【推荐】不得不看的载体构建的心得与体会

这两年在美帝净做克隆实验了，以前读PHD时候还觉得自己分子克隆挺牛X的，来这边之后做了各种各样的构建才知道以前是坐井观天，刚才粗粗统计了一下，在美帝一年零八个月，我构建的质粒的超过四百个，其中有很简单从PCR构建到拿WB结果的一共不到一周，也有巨难的花了四个月时间换了几次strategy才弄好激动得我半夜給老板发信的品种;有单片段酶切插入这种不用脑型的，也有九个片段逐一插入正反向还不同的。专家不敢说，但是熟能生巧，确实积累了不少经验，现在系里从POSTDOC到PHD学生到TECH构建前很多人都跟我商量(做博后结果成了技术员的人生真悲哀啊)。

我老板甚至开玩笑说，我们将来开个公司，我专门负责构建(这话听得我想揍他大家同意不?)

想了想还是把经验写下来，一来做个记录，二来博同行一笑，能让大家少绕点弯路则更好。

1. 准备工作

俗话说用欲善其事，必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具，这样起的效果事半功倍。

这里说个笑话，我们系有个新PHD学生，是个印度女孩，很聪明很刻苦，她所在的实验室也很好，不过除了她之外包括老板在内都是生物物理背景的，以前一个生物POSTDOC在的时候还好，这个POSTDOC一走，整个实验室对分生就只有一个粗浅的概念，这个女孩就想把一个质粒上的基因插到另一个质粒上去，要是我就先查查有没有合适的酶切位点，要没有就改造一下质粒一切搞定，这女孩她不懂啊(要命的是她老板固然牛，对这方面也不懂)，自己辛辛苦苦设计了PCR引物去做PCR，P了将近5K的产物去测序，结果测的结果中间有个MUTATION，要懂行的就找找酶切位点，从原来的替换上去，然后测这下这段就行。她呢，又送去了若干了质粒一个接一个的测，一个测序反应这边是8刀,一个质粒测下来就是40刀，她光测序就要花好几百刀(你得佩服老美实验室真有钱呀)。

这件事教育我们准备工作是多么重要。

这里推荐大家两个工具，一个都知道，PRIMER5.0。另一个工具极强大，也不知道国内流行不，叫lasergene，包括设计引物到构建图谱一应俱全，图谱非常漂亮，而且分析酶切位点等等就超NB，如果感兴趣的话我可以給大家传一个图谱看看。

2. PCR

如果没有现成的质粒可供酶切，PCR是最理想也是最方便的策略。关于PCR具体技术坛子内帖很多，我不多说了，这里仅在构建方面谈一谈。

（1）如何设计引物?

首先，看懂质粒图谱!

拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。想用N1质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白，你就死了;C1质粒，注意frame，要是移码了，你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱!再多一句，PEGFP的XBA1和Bcl1位点不能用。

注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基(大家要用T载体就当我没说)。酶切位点设计也有一定的讲究，我的原则是，能用粘端就用粘端，实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如ECORV和SNAB1之类，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算TM的时候要减去这些不match的序列，或者选用touch-up策略。

除了酶切位点，还要注意KOZAK序列的问题，很多质粒没有提供KOZAK序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。

GENE OVERLAP也比较有用，比方说加个FLAG片段，HIS片段，2A序列之类的，直接设计三引物OVERLAP一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。

引物长一点不要紧(我最喜欢两步法了)，尤其是对GC比高的序列，有时候引物不长PCR根本不出结果，注意如果GC比较高，这个时候GENE OVERLAP就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。

（2）没有合适的酶切位点?

很简单，用同尾酶策略，比方说Bgl2和BamH1,Nhe1和spe1，Xho1和Sal1(注意连上了切不下来)，实在不行就平端吧，只要不超过4KB，平端酶连接也不那么难。

（3）如何选择Taq酶?

选择Taq酶也很关键，首先，高保真(High fidelity)这是必须的，我在国内常用LA KIT，可这边**忑贵，只好用(美)国货。

常用的PFU，PHUSION和PFX。PFX50是invitrogen公司的，一度曾卖到脱销，保真性应该是目前最高的，是普通Taq的50倍，对一般基因绝无问题(我同事4.5K PCR产物,居然一个突变都没有)，但是对比较难PCR的高GC或者位点比较难做PCR的基因(基因组为模板)就明显不行了;PFU(安捷伦)保真性没有PFX50高，但是能力很强，略贵点;phusion是NEB公司的，不贵，但是这个酶很怪异，每次用都要把annealing温度调高好几度，否则就出杂带，个人觉得NEB内切酶绝对是NO.1，但是Taq就不如Invitrogen了，如果实验室有钱，直接买invitrogen的spuermix，什么都混好了，连ddH2O都搞定，只要直接向里加模版和引物就OK，每次我要拿漂亮的结果都用supermix。

还是那句话，读说明书。同是高保真Taq酶，iproof 要求98度起始1min，pfx就要求95起始2min ，延伸有的是72，有的是68，有的要加1uL,有的加0.5，有的TM要低五度，有的高三度，这些必须要读说明书，读且仔细读，这是拿到任何试剂都要做的第一步。

（4）如果基因太难PCR，怎么办?

首先，DMSO是好物，好到甚至FISHER的Phusion就直接写上了DMSO这项，注意3%-6%，太高Taq酶活性就不行了。如果GC太高而且片段过长的话，DMSO也不行，GC低的不推荐。

我做个过一个2.8 k,GC比高达92%的基因PCR，一共做了两周，从保真性最强的PFX50到普通的promega 2xGO Taq都试过，什么DMSO，甘油，Biorad的iproof with high GC Buffer, NEB one Taq 2x Taq High GC(还带Enhancer的)，TAKARA 的LA都试过，都不行，要么不出带，要么就是乱七八糟的带一起来，头晕脑涨的我都打算抹平策略了，后来从别的实验室弄来一个clontech的2 GC rich kit，一次搞定!

强烈推荐这个KIT，太牛了，在别家都缴械的时候，它一锤定音，不过价格也比别家都牛，10次反应就130刀，其实实验室大可以备一个，就是防备超高GC又长的片段。不过这个KIT非高保真，送了三个克隆测序，各在不同部位有突变，于是我就从A克隆切一段接到B克隆上，又从C克隆切一段接B克隆上。注意的问题是GC比太高测序也很困难，正常GC能测1K左右，到了High GC就能测个五六百，这时要多准备些引物。

（5）PCR产物的纯化

如果带很单一，又强，直接PCR产物纯化就可以，如果有杂带，但目的带也很强，跑胶，目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈，就是回收率的问题，我试过很多家的KIT，promega的GEL回收试剂盒效率和价格都很合适，推荐这个。

关于T载体，我在国内的时候是必用的，到了美帝反倒一次没用过，这边比较流行直接用PCR产物切，就是回收完了直接切上，回收后然后连接，这又回到了最开始设计，要加保护碱基。这个策略好处就是免除了T载体这步，直接插入目的载体，存在的问题就是处于盲做状态，还要加保护碱基。

3. 酶切

我的原则一向是：尽量避免PCR，能酶切的多酶切，实在没办法才去PCR。

这里强烈推荐NEB的内切酶，还记得在有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了(当然当时质粒浓度也不高)，而用NEB的酶，切个七十二小时仍旧一切OK，尤其现在NEB还推出了HF的内切酶，没有星活性而且统一都用Buffer4，很好用，在国内我都用TAKARA的酶，基本上还可以。

注意要读说明书，选用什么buffer，多少度，用不用加BSA，这些都要仔细读。

酶切的起始量，PCR产物没甚么可说的，全都切上，如果是从质粒上切片段，要根据你片段大小，片段适中，比如说7 kb质粒，有2 KB是目的片段，这时切个3-4 ug就足够了，如果只有0.2 KB,那最好多切点，6 ug-7 ug　内切酶也没问题。

4.连接

最常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用，但是注意Buffer里有ATP，反复冻融ATP失活得很快，这时有两种办法，一种是象我们chair实验室，每次连接都统统朝里面加1uL ATP;另一种是我们实验室的策略，拿到buffer就分装，10 uL/管，一次性使用，哪怕就用1uL，剩下的直接扔掉。

连接最重要的注意事项：

（1）载体总量；

（2）载体和插入片段比例；

（3）载体和插入片段质量。

我在回收之后都要测载体浓度，一般来说，载体浓度在20-100 ng/uL很好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从50-100 ng就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用10-15 uL，我试过25 uL没有问题，40 uL就不行了。

载体和插入片段比例一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高载体浓度，同时加大比例1:10，我试过一端平一端粘连接，4 kb片段，4KB载体，连接成功率相当高，10个克隆里8个都是阳性的，但是7 KB片段，5 KB载体的平端连接就连试两周都失败，最后换策略分两段先后克隆进去的，这也給了我很深教训，隔了一阵又做类似的实验，这回我干脆连试都没试，继续分成两段分别连进去的。

3片段连接同理，如果片段不太大，比方说小于3 K，3片段连接成功几率很高，但是如果你片段太大，就不行了，我试过4 K载体，4 K片段A，2 K片段B连接，失败四五次，最后还是绕路走了。

5. 转化

这个简单遵循基本的准则就行，话说实验室原来从sigma买感受态(competent cell)，后来发现还是自己做的效率高，尤其在使用XL-10细菌的时比DH5a效率要高，需要的话我可以发protocol上来。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素，实验室原来有个volunteer，做一次失败一次，我就奇怪了，后来才发现他用的居然是加了KANA的LB，直接晕过去了。还有就是氯化钙的问题。氯化钙吸水性很强，吸水后就完蛋了，我一般把它放在干燥罐里(反正我也不知道啥名字，就那种玻璃罐，干燥用的)，大家要不放心，用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。

6. 鉴定

普通实验做酶切鉴定，阳性率非常高，大多数情况下四个中起码有三个是正确的，很多时候都是百分百正确，这里推荐一种叫fast digest的酶，切个十几分钟跑胶就行了。

如果找不到合适的酶切位点或者有其他问题，比方说有段时间我做个非常新潮的实验，初始步骤的虽然是蓝白筛选，但是白斑也大部分都不对，没办法鉴定就用菌液PCR，最夸张的一次是五十个白斑里面居然就一个阳性的(没办法，该实验特点)，这要提质粒可提不起。

菌液PCR也有讲究，很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多，为甚么?因为你PCR引物选的都在载体上，注意，引物必须分别在载体和插入片段上才准，PCR方法鉴定是极其准确的，我做过数百次菌液PCR，只要PCR条件正确，PCR和酶切结果绝对百分之百对得上。PCR鉴定做起来也很简单，拿个2 mL tube，装0.5 mL 加入相应抗生素的LB，摇个三小时左后取1 uL做模板就行了，楼下有个实验室的POSTDOC特喜欢做直接的菌落PCR，我没试过，效果怎样不好说。

还要多说一句，要注意质粒是低拷贝还是高拷贝，普通的质粒一般4mL摇过夜，1.5 mL就能提到500 ng/uL　总体积40 uL的质粒(根据试剂盒不同，最高提过800 ng/uL，也试过200 ng/ul，都正常)。如果是低拷贝质粒，象PET系列和pshuttle系列，都是低拷贝，能拿到100 ng/uL就已经很好了，这时候需要4 ML菌当2 ML提，但是最要命的还是Adeasy 质粒(用来做腺病毒的)，这个质粒超过30 KB，普通KIT回收效率低到忍无可忍，一定要用特定的试剂盒才行，还是那句话，这些都要读说明书。

7. 测序

我们拿到测序结果时候，不仅要核对具体的序列，而且要看测序图，这很重要，因为有时候光看结果对，实际上图显示的不对，或者虽然结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子，还要重点检查的地方就是“接头”的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一或者俩碱基什么的(这些问题我都碰到过)，如果不仔细检查到了后期悔之无及。

还要注意反向测序引物，尤其用到SV40，因为我用PEGFP这套质粒用习惯了，等换成大概是TET-ON那套系统，SV40正好是反过来的，我也没留神，结果测回来的是载体……又吃了一次教