原理
采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。
材料与仪器
质粒DNA
限制性核酸内切酶 蒸馏水
微量移液枪 离心机 电泳仪 水浴锅 紫外透射观测仪 离心管 记号笔
限制性核酸内切酶 蒸馏水
微量移液枪 离心机 电泳仪 水浴锅 紫外透射观测仪 离心管 记号笔
步骤
一、实验材料准备
1. 材料：质粒DNA。
2. 试剂：限制性内切酶、ddH2O。
3 . 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪。
二、单酶切
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：
（1）质粒DNA：X uL（约1 ug）。
（2）限制性内切酶：1 uL（约10 U）。
（3）10xbuffer：2 uL。
（4）ddH2O：补足20 uL。
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：
（1）质粒DNA：X uL（约1 ug）。
（2）限制性内切酶：1 uL（约10 U）。
（3）10xbuffer：2 uL。
（4）ddH2O：补足20 uL。
2. 混匀，做好标记。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反应。
5. 电泳检测酶切效果。
三、双酶切
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：
（1）质粒DNA：X uL（约1 ug）。
（2）限制性内切酶1：1 uL（约10 U）。
（3）限制性内切酶2：1 uL（约10 U）
（3）10xbuffer：1或2 uL。
（4）ddH2O：补足20 uL。
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入：
（1）质粒DNA：X uL（约1 ug）。
（2）限制性内切酶1：1 uL（约10 U）。
（3）限制性内切酶2：1 uL（约10 U）
（3）10xbuffer：1或2 uL。
（4）ddH2O：补足20 uL。
2. 混匀，做好标记。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反应。
5. 电泳检测酶切效果。
四、结果与分析
假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点， 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果，则单酶切应为一条带， 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值，那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。
注意事项
1. 酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1 ug/10U；所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4―5hr， 甚至过夜。灭活限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。
2. 双酶切体系缓冲液添加量要根据两种限制性内切酶最佳缓冲体系，可以登录限制性内切酶购买公司官方查看。
2. 双酶切体系缓冲液添加量要根据两种限制性内切酶最佳缓冲体系，可以登录限制性内切酶购买公司官方查看。
来源：丁香实验
