将载体和目的片段（PCR扩增产物，约500bp,两端设有酶切位点）分别用EcoR1和BamH1双酶切后，定向连接。但载体上该双酶

建议直接挑克隆测序，就知道是否酶切连接成功。

EcoRI 和BamHI切了多长时间？这两个酶都有星号活性。建议你跨载体和目的片段，设计引物做菌落pcr鉴定吧。

如果 pCR 没有污染

1、假设选的是单菌落，则有可能是因为自己引物非特异扩增。2、假如PCR 没有问题，最可能是菌被污染，连上了，但有污染。这种可能性大。假阳性产生的可能性极大。3、最好重新挑cone，摇菌。如果不行再用通用引物确定是否没有连上。4、应该使用载体引物来作PCR 鉴定，因为自己的引物作很有可能出现假阳性。5、片断是500bp的，而载体切下来的片断中含有800bp，是否是因为重组质粒的浓度太低，使得800bp的片断可以见到，而没有办法看见 500bp 的，所以建议将重组质粒酶切量增加，电泳时上样量增加。6、 可以看到 800bp 的片断，应该是教体自连接，因为插入片断后载体的酶切位点移位。应该没有办法再次切下 800bp 的片断，所以建议重新挑菌再作。7、如果您能PCR检测出您提取的质粒中含有目的片而双酶切时却只能显示应该切除的片断，说明可能出现的情况是，你的连接成功，但是你挑取的菌落并不是单克降，而是包含有假阳性(也就是自连接的所粒菌落)的混合菌落,而且假阳性菌落比例高于需要的阳性菌落。导致在进行摇菌扩增质粒时，同时大量扩增了假阳性质粒。从而出现上面描述的情况8、如果打算从新开始酶切,连接,转化的话,建议加大酶切时酶的使用量，在酶切片渐回收时尽量不要切下杂带，这样可以尽量减少自连假阳性的可能性。

可以选择那个和设计不相同的那一端的酶切位点先做连接，之后再进行平化连接， 这样就可以避免所设计中的有重复酶切位点的问题了。部分酶切关键是酶切时间，可以先摸索一下酶切的时间。在一个大一点的体系中(比如150微升体系)，37度酶切，然后每隔一段时间取出一部分(比如5微升或10微升)，然后一起进行核酸电泳，摸索一下合适的酶切时间，部分前切的话，时间应该不能太长，可以每间隔5分钟或10分钟左右就取一次。