PCR产物双酶切及与载体的连接

一、目的与意义

学习使用限制性内切酶切割带有相应酶切位点的PCR产物，并将克隆载体与外源DNA片段进行体外连接，以构建重组DNA。

二、实验原理

外源基因（DNA片段）很难直接通过细胞膜进入受体细胞，即使进入，也会受到细胞内限制性酶的作用而分解。要将外源DNA片段导入受体细胞，必须选择适当的载体（Vector）。

载体是携带外源基因进入受体细胞的工具，作为载体的DNA分子，需具备三个基本条件:

①容易进入寄主细胞；

②进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制和表达；

③容易从宿主细胞中分离纯化。

在基因工程中常用的载体有：

1.质粒——环状双链小型 DNA 分子，种类丰富,常见的有pUC系列、pET系列等。

2.噬菌体——如λ噬菌体，用于细菌细胞。

3.病毒——如猿猴空泡病毒SV40，常用作动物细胞基因工程的载体。

含有目的基因的DNA片段和载体DNA连接技术即DNA重组技术，其核心步骤是DNA片段之间的体外连接，涉及限制酶、连接酶等的酶促反应。把目的基因连接到载体上，需经过一系列酶促反应，涉及几种工具酶，其中最为重要的是两大类酶：

① 限制性内切酶：把载体DNA切开形成平端或粘末端。

pUC18/19是常用的质粒载体，其图谱如右所示：
pUC18/19的多克隆位点如下所示：

三、实验仪器

1. 离心机

2. 移液器16套（每2人1套）