pcr产物双酶切后连接只长出原载体，请问哪里出了问题
ddlyy
我想通过两次pcr分别获得载体片段和目的片段，然后分别进行双酶切，再t4连接，连接后电泳显示多个连接产物条带，转化以后长出来的菌提质粒pcr不成功只能p出杂带，选择直接质粒电泳结果全部都和原载体一样，（我的质粒是低拷贝，提完质粒浓度不够测序
）
左边的六个是重组子提质粒电泳结果，第七个是原载体质粒电泳（7kbp），右边七个是质粒pcr结果全都在2000的位置有一个杂带
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3 个回答
周末也要努力呀
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推测可能出现以下几种情况：
1. PCR产物没有成功双酶切：请确保PCR产物已经成功进行了酶切反应，并且使用了正确的酶切酶和相应的缓冲液。
2. 双酶切产物没有经过凝胶电泳纯化：在连接之前，需要将双酶切产物进行凝胶电泳分离，并纯化目标片段，以去除其他杂质。
3. 连接反应条件不正确：连接反应需要使用适当的连接酶和缓冲液，并在正确的温度和时间下进行。请确保连接反应条件正确。
ddlyy
请问双酶切后使用柱回收可以吗，胶回收之前做过，回收效率太低，尝尝测不出来浓度，或者有什么办法提高胶回收效率吗
高山云初
有帮助
引物设计不合理或者模板DNA的污染或降解
ddlyy
主要是我模板在左边的电泳里看着也没什么污染，但是条带基本就两条，奇怪的是超螺旋跑的太快，我7k的质粒跑出来显示2k的条带，搞不清楚是为什么
粥辰辰辰辰
有帮助
在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的选择非常重要,尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后,在各个酶的两边加上保护碱基
ddlyy
保护碱基我就按照网上搜到的加的，而且我过夜酶切，连接以后我还跑了电泳看连接效果，结果显示有一些连接上了，但是显示有多个连接产物也有点弄不清为什么，连接后电泳图我也放一下
右边的在5kbp左右的就是我的连接产物，但是呈现多条带，不知道为啥
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