🔥 粘性末端克隆

限制性内切酶能够识别并酶切双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，使目的 DNA 片段和载体产生不平齐的粘性末端，然后在 DNA 连接酶的作用下，将酶切后的目的 DNA 片段和载体进行连接，构成重组载体。

构建质粒。

（1）PCR：按照 PCR 试剂说明书（天根 KT211），加入目的 DNA 或者 cDNA、引物、PCR 试剂、ddH₂O 等，按照程序进行 PCR 扩增。参考体系如下：

程序如下：

扩增完成后，将 PCR 产物按 120 V 30 min 的条件进行琼脂糖凝胶电泳，一般情况下琼脂糖凝胶的浓度为 0.8%~1.0%。在核酸凝胶成像仪中观察目的条带，将目的凝胶切割下来，按照 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，获得目的 DNA 片段。

（2）酶切：按照限制性内切酶说明书（Thermo Scientific），将目的 DNA 片段和载体质粒进行酶切，通常 1~2 μg 质粒在 37 ℃ 酶切 2.5~3 h 足够，将酶切后的目的 DNA 片段和载体进行琼脂糖凝胶电泳和回收。

（3）连接：按照 T4 DNA 连接酶（Takara 2011A）说明书进行连接，目的 DNA 片段与载体的摩尔比建议为 3:1 - 6:1，总质量控制在 100~200 ng，4 ℃ 连接过夜或者 16 ℃ 2~3 h。

（4）质粒转化：从 -80 ℃ 冰箱取出感受态细胞（大肠杆菌，如 DH5α）置于冰上融化，加入连接产物轻轻混匀后放置冰上 30 min，42 ℃ 热激 45 s 后再放置于冰上静置 3 min。

在超净工作台中加入无抗 LB 肉汤培养基 500 μL，轻轻混匀放置于 37 ℃ 摇床中 200 rpm 震荡培养 1 h 后，5000 rpm 离心 5 min 收菌，留约 100 μL 上清轻轻吹打混匀，均匀涂布接种于含抗生素的固体 LB 平板中，置于 37 ℃ 培养箱中正放 5 min 使液体被吸收。

然后再倒置固体 LB 平板，继续在 37 ℃ 培养箱中培养 12~16 h 左右可出现单个菌落。

（5）质粒提取：挑取单个菌落于 1.5 mL EP 管中，振荡培养 1~2 h 后取一微升作为模板，进行菌液 PCR 验证，观察是否出现目的条带，进一步将上述验证正确的菌液，加入 5~20 mL 含抗生素的 LB 肉汤培养基，37 ℃ 摇床培养过夜（12~16 h），按照质粒抽提试剂盒进行提取，可以再次酶切或者测序验证。

（1）若 PCR 产物不立即回收，应取出放在 4 ℃ 保存（短时间），或者也可琼糖凝胶电泳后切下目的片段条带，贮存于 -20 ℃（可放置时间较长），一般不建议 PCR 产物放置过久，最好直接电泳和回收。

（2）酶切时体系中的酶的用量原则是酶的总量不能超过体系的 1/10，一般在 37 ℃ 酶切 3 h 便足够。

双酶切的时候要注意同尾酶的情况，如 SalⅠ与 XhoⅠ，Bgl Ⅱ 与 BamHⅠ互为同尾酶，能产生相同的粘性末端；载体单酶切是通常要考虑载体的自连，因此连接前可以经过小牛肠碱性磷酸酶（CIP）去磷酸化处理。

阳性克隆少。可能载体酶切不够充分，或者质粒转化感受态的效率低。可以用酶切后未连接的载体作为阴性对照，质粒作为阳性对照进行转化。