提问
提问
我要登录
|免费注册
收藏
wx-share
分享

🔥 分子克隆技术

实验分类:

DNA 实验

最新修订时间:

简介

分子克隆是将重组DNA插入到载体中的一套方法,载体作为DNA分子的携带者,将在宿主体内复制重组DNA片段。

原理

分子克隆是指分离一个已知DNA序列,并以in vivo(活体内)方式获得许多复制品的过程。这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因,但也可用来增加某些任意的DNA序列,如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的DNA片断。

应用

克隆技术

来源:丁香实验

操作方法

🔥 快速点突变分子克隆

利用一次 PCR 方法进行定点突变分子克隆,较盒式突变及其它传统方法更快速简便。

🔥 SLIC 克隆

SLIC 克隆是一种基于 DNA 重组技术的克隆方法,通过利用外源 DNA 和目的 DNA 的线性化切片段相互衔接,使用序列无关的连接酶将它们连接起来,从而实现基因片段的拼接。

🔥 Topo 克隆

是一种基于转座子元件的 DNA 插入方法,适用于插入小片段的 DNA 序列(约为 4~5 kb)。

🔥 粘性末端克隆

(1)PCR:按照 PCR 试剂说明书(天根 KT211),加入目的 DNA 或者 cDNA、引物、PCR 试剂、ddH2O 等,按照程序进行 PCR 扩增。参考体系如下:程序如下:扩增完成后,将 PCR 产物按 120 V 30 min 的条件进行琼脂糖凝胶电泳,一般情况下琼脂糖凝胶的浓度为 0.8%~1.0%。在核酸凝胶成像仪中观察目的条带,将目的凝胶切割下来,按照 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂

🔥 一步法克隆

一步法克隆是一种简单、快速和高效的克隆技术,现有许多一步法克隆试剂盒可以买到,它能够将扩增的 DNA 产物定向插入任何线性化载体的任何位点,线性化的载体和插入片段的 PCR 产物无需纯化即可直接用于重组,非常简便。

TA 克隆

(1) PCR:按照 PCR 试剂说明书(天根 KT211),加入目的 DNA 或者 cDNA、引物、PCR 试剂、ddH2O 等,按照程序进行 PCR 扩增。注意所使用的酶可以在 3’端添加 A。参考体系如下:程序如下:扩增完成后,将 PCR 产物按 120 V 30 min 的条件进行琼脂糖凝胶电泳,一般情况下琼脂糖凝胶的浓度为 0.8%~1.0%。在核酸凝胶成像仪中观察目的条带,将目的凝胶切

Gateway 克隆(BP 反应)

Gateway 克隆属于高效大规模克隆系统,是利用载体上一系列特殊的酶,可以高效、方便、快速地将不同 DNA 序列拼接在一起,将目的基因克隆到受体上用于重组表达载体、RNA 干扰载体、报告基因载体等等。

Gateway 克隆(LR 反应)

Gateway 克隆属于高效大规模克隆系统,是利用载体上一系列特殊的酶,可以高效、方便、快速地将不同 DNA 序列拼接在一起,将目的基因克隆到受体上用于重组表达载体、RNA 干扰载体、报告基因载体等等。

Gateway 克隆(入门载体的构建)

Gateway 克隆属于高效大规模克隆系统,是利用载体上一系列特殊的酶,可以高效、方便、快速地将不同 DNA 序列拼接在一起,将目的基因克隆到受体上用于重组表达载体、RNA 干扰载体、报告基因载体等等。

🔥 分子克隆实操技术

1、首先合成引物对目的基因进行 PCR 扩增,将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,并回收目的 DNA 片段。2、将目的 DNA 片段和载体质粒进行酶切,回收后进行连接,建议 4 ℃ 连接过夜。3、转化感受态细胞。取出感受态细胞置于冰上融化,加入连接产物轻轻混匀后放置冰上 30 min,42 ℃ 热激 45 s 后再放置于冰上静置 3 min。在超净工作台中加入无抗 LB 肉汤培养基 500 μL,

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序