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🔥 SLIC 克隆

相关实验:🔥 分子克隆技术

别名:Sequence and Ligase Independent Cloning,无序列连接克隆

最新修订时间:

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合作专家 | 郭新容硕士

临床医学 中南大学

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审核专家 | 王淼博士

病原微生物 中国农业科学院

简介

SLIC 克隆是一种基于 DNA 重组技术的克隆方法,通过利用外源 DNA 和目的 DNA 的线性化切片段相互衔接,使用序列无关的连接酶将它们连接起来,从而实现基因片段的拼接。

原理

SLIC 克隆主要基于两个步骤:线性化切割和连接。在线性化切割过程中,外源 DNA 和目的 DNA 序列通过酶切割成线性分段。在连接的过程中,线性分段的 DNA 序列在一定温度下自行重新组合,并利用 T4 DNA 连接酶将其粘合在一起,形成目的克隆基因。

用途

SLIC 克隆技术可以用于构建各种表达载体、RNA 干扰载体和报告基因载体等。通过 SLIC 技术,可以方便快捷地将多个基因片段组合成一个表达载体,从而实现对基因表达的调控、表达定位和功能研究等。

材料与仪器

目的载体:含有目的基因片段克隆位点的质粒。

目的基因片段:需要克隆到目的载体中的基因片段。

切割酶:如 EcoRI、BamHI 等。

连接酶:如 T4 DNA 连接酶。

甲基化酶:如 DpnI 等。

GeneArt™ kit(Invitrogen Cat: A14606)

步骤

1、制备目的载体:选择合适的目的载体,并进行限制性内切酶切割,线性化目的载体。

2、PCR 扩增基因片段:从源 DNA 中扩增所需基因片段,并在 PCR 反应中加入适当的引物,添加适量的 dNTPs,并使用高保真 Taq DNA 聚合酶。用 Dpn1 酶消化 PCR 产物,去除质粒模板。

3、准备 DNA 片段:将 PCR 产物进行电泳分离,并切下目的片段,将其纯化。

4、准备连接片段:将质粒载体酶切线性化。

5、连接反应:将准备好的 DNA 片段和连接片段放在一起进行连接反应,加入连接酶。
反应体系如下:

DNA 片段 200 ng/each X μL
线性化载体 50 ng 1 μL
水 到 5 μL
2X Enzyme Mix(最后加入) 5 μL

6、室温孵育 15~30 分钟。

7、将混合物转化到大肠杆菌感受态细胞:用热激转化法将反应混合物转化到大肠杆菌细胞中。

8、将细菌涂布到含有抗生素的固体培养基上:将细菌涂布到含有适当抗生素的固体培养基上,放置在 37 ℃ 下培养过夜。

9、筛选重组菌落:根据抗生素的抗性判断是否有重组菌落出现,取出重组菌落进行 PCR 检测。

10、测序验证:对所得的克隆质粒进行测序验证,确认所得的克隆是正确的。

注意事项

(1)特别注意质粒的选择和酶的消化条件,以避免误切或未切割的情况。

(2)PCR 产物用 Dpn1 酶消化,去除 PCR 反应中的模板质粒残留,以避免产生假阳性。

来源:丁香实验

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