🔥 SLIC 克隆

SLIC 克隆是一种基于 DNA 重组技术的克隆方法，通过利用外源 DNA 和目的 DNA 的线性化切片段相互衔接，使用序列无关的连接酶将它们连接起来，从而实现基因片段的拼接。

SLIC 克隆主要基于两个步骤：线性化切割和连接。在线性化切割过程中，外源 DNA 和目的 DNA 序列通过酶切割成线性分段。在连接的过程中，线性分段的 DNA 序列在一定温度下自行重新组合，并利用 T4 DNA 连接酶将其粘合在一起，形成目的克隆基因。

SLIC 克隆技术可以用于构建各种表达载体、RNA 干扰载体和报告基因载体等。通过 SLIC 技术，可以方便快捷地将多个基因片段组合成一个表达载体，从而实现对基因表达的调控、表达定位和功能研究等。

目的载体：含有目的基因片段克隆位点的质粒。

目的基因片段：需要克隆到目的载体中的基因片段。

切割酶：如 EcoRI、BamHI 等。

连接酶：如 T4 DNA 连接酶。

甲基化酶：如 DpnI 等。

GeneArt™ kit（Invitrogen Cat: A14606）

1、制备目的载体：选择合适的目的载体，并进行限制性内切酶切割，线性化目的载体。

2、PCR 扩增基因片段：从源 DNA 中扩增所需基因片段，并在 PCR 反应中加入适当的引物，添加适量的 dNTPs，并使用高保真 Taq DNA 聚合酶。用 Dpn1 酶消化 PCR 产物，去除质粒模板。

3、准备 DNA 片段：将 PCR 产物进行电泳分离，并切下目的片段，将其纯化。

4、准备连接片段：将质粒载体酶切线性化。

5、连接反应：将准备好的 DNA 片段和连接片段放在一起进行连接反应，加入连接酶。
反应体系如下：

6、室温孵育 15~30 分钟。

7、将混合物转化到大肠杆菌感受态细胞：用热激转化法将反应混合物转化到大肠杆菌细胞中。

8、将细菌涂布到含有抗生素的固体培养基上：将细菌涂布到含有适当抗生素的固体培养基上，放置在 37 ℃ 下培养过夜。

9、筛选重组菌落：根据抗生素的抗性判断是否有重组菌落出现，取出重组菌落进行 PCR 检测。

10、测序验证：对所得的克隆质粒进行测序验证，确认所得的克隆是正确的。

（1）特别注意质粒的选择和酶的消化条件，以避免误切或未切割的情况。

（2）PCR 产物用 Dpn1 酶消化，去除 PCR 反应中的模板质粒残留，以避免产生假阳性。