pcr产物双酶切后连接只长出原载体，请问哪里出了问题

可能是酶切失败，内切酶特异度不足导致的

1. 首先核对pcr产物内部序列是否存在双内切酶的酶切位点，如果存在需要考虑重新设计酶切位点或者更换连接方法
2. 检测原载体是否酶切完全

检查下PCR片段中有没有这两个酶切位点（酶切后跑个电泳看看切后的条带有没有变化）

可以将酶切后的PCR片段送测序，看看末端是不是真的没切开

最大的可能就是内切酶特异度不足，酶切失败