🔥 快速点突变分子克隆

利用一次 PCR 方法进行定点突变分子克隆，较盒式突变及其它传统方法更快速简便。

PCR 原理: 在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程。

DPNⅠ酶消化原理：DPN1 是一种限制性核酸内切酶，能够特异性切除甲基化的 DNA 链。定点突变后，我们需要区分并去除原始 DNA（未突变模板）。模版质粒来源于大肠杆菌，是经 dam 甲基化修饰的， DpnⅠ识别甲基化的 GATC 中的 A，而 GATC 在几乎各种质粒中都会出现，且不止一次，因而模板链对 DpnI 敏感而被切碎；而体外合成的带突变序列的质粒来源于 PCR 没有被甲基化，不能被 DpnⅠ识别剪切，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。

用于在质粒中引入少数碱基的定点突变。

① 模板质粒

② 高保真 PCR 混合酶（诺唯赞，P520-01）

③ 合成引物序列

④ 去离子水

一、设计引物

如图在欲突变位点设计 PCR 定点突变所需引物，设计的引物需含有突变后碱基序列，订购引物。

二、质粒 PCR

将稀释好的质粒模板与订购的引物以及其他试剂按如下比例混合（50 μl）：

将混合好的体系进行 PCR，程序如下：

步骤 ②-④ 重复 28 次循环。 根据酶的扩增效率及目的片段大小选择延伸时间。例如：酶的扩增效率为 1 000 bp/min，质粒大小为 9 000 bp，则 X 为 9 min。

三、DPNⅠ 酶消化

将 PCR 后的产物和 DPNⅠ 按一下比例混合，消化模板质粒：

四、转化

将连接好的完整质粒，转化 DH5-α 感受态细胞中，冰上孵育 30 min，42 ℃ 热击 90 s，再置于冰上冷却 5 min，完成转化。用稀释涂布法将感受态溶液涂至含有相应抗性的 LB 固体培养基表面， 37 ℃ 培养箱中过夜培养，次日会长出菌落，挑取菌落进行测序。

1、模板投放量不应过高，会使得消化不完全，长出未突变的菌株。

2、循环数不应该太多，18 个循环足够，由于 PCR 区域是整个质粒，时长会很久，在循环后期酶的活性可能会下降，保真性变差。

1、PCR 后无条带，可能是引物设计中 GC 含量过高，导致引物碱基数过少，应尽量延长引物长度。

2、若测序阳性率低，检查模板投放量是否过多，或 DPNⅠ 酶失活，使得消化不完全，长出未突变的菌株。

3、若未长出菌落，检查模板质粒是否变质，或实验过程是否有其他意外。