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🔥 分子克隆实操技术

相关实验:🔥 分子克隆技术

别名:Molecular Cloning,Molecular Cloning ,DNA分离

最新修订时间:

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合作专家 | 张荣钊博士

病原生物学 福建医科大学

材料与仪器

目的 DNA 或者 cDNA

引物(带有酶切位点和保护碱基等)

PCR 试剂、载体质粒、限制性内切酶

琼脂糖、DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒

T4 DNA 连接酶、大肠杆菌

LB 平板和 LB 肉汤培养基

氨苄或者卡那抗生素、质粒抽提试剂盒

步骤

1、首先合成引物对目的基因进行 PCR 扩增,将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,并回收目的 DNA 片段。

2、将目的 DNA 片段和载体质粒进行酶切,回收后进行连接,建议 4 ℃ 连接过夜。

3、转化感受态细胞。取出感受态细胞置于冰上融化,加入连接产物轻轻混匀后放置冰上 30 min,42 ℃ 热激 45 s 后再放置于冰上静置 3 min。

在超净工作台中加入无抗 LB 肉汤培养基 500 μL,轻轻混匀放置于 37 ℃ 摇床中 200 rpm 震荡培养 1 h 后,5000 rpm 离心 5 min 收菌,留约 100 μL 上清轻轻吹打混匀,均匀涂布接种于含抗生素的固体 LB 平板中,倒置于 37 ℃ 培养箱中培养 12~16 h 左右。

4、筛选阳性克隆。挑取单个菌落于 1.5 mL EP 管中,振荡培养 1~2 h 后取 1 μL作为模板,进行菌液 PCR 验证,观察是否出现目的条带。

5、试管扩大培养。将上述验证正确的菌液,加入 5~20 mL 含抗生素的 LB 肉汤培养基,37 ℃ 摇床培养过夜(12~16 h),按照质粒抽提试剂盒进行提取,可以再次酶切或者测序验证。

来源:丁香实验

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