无缝克隆如何设计引物？引物一般设计多长？很长的引物需要找公司定制吗？

• 一段20bp基因的引物，加上20bp载体上的引物作为overlap，一共40bp左右，上海生工就可以，不需要定制

接头两边至少个20-25个bp的overlap

引物一般设计长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp。

根据同源臂设计引物，一般15-20bp。很长的引物需要找公司定制。

现在网上有设计的小程序，你去neb官网看看。一般接头两边至少个20-25个bp的overlap。你设计好发公司就行，不是特殊定制的

原则：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列 (15 bp～25 bp)。

可以找公司也可以自己做，网上有很多视频可以学习。

SnapGene设计无缝克隆引物

1打开需要进行插入片段的载体

2选择菜单栏中“Action”中“In-Fusion Cloning”“Insert Fragments”

3在“vector”载体map中选择载体酶切位点

注意黑体加粗酶切点为单酶切位点，一般细体酶切位点名为双酶切位点！

4在“Fragment”中“Source of Fragment”选择需要插入的目标片段

5product设置“choose overlapping PCR Primers”一般我们选择引物退火温度为60，overlap为“20”勾选上“重建载体重新生成酶切位点”“choose primers”

6选择右下角clone生成新的重组载体

7返回到新构建成的载体序列就看到我们需要的无缝克隆引物啦