【求助】酶切连接构建的载体测序结果存在突变
月亮孩子OHPJ
求助各位大神有哪些可能造成突变的原因
使用酶切-连接的方式构建载体
插入片段是从另一个已经构建好的载体上切下来的，和骨架载体一起酶切，切胶回收，使用的是蓝光切胶仪，理论上不太可能引起突变
T4连接酶4℃过夜连接。
转化DH5α感受态细胞，涂板。
挑了10个菌落，酶切鉴定后5个阳性，送测序
所有测序结果与预期的序列比对都有单碱基突变，且突变位置不同。与测序公司交流后测序公司表示测序结果没有问题。
该实验期间有用同源重组方法构建的另一个载体（插入片段和载体都通过PCR方式获得），感受态细胞，培养基（抗生素不同），胶回收/产物回收试剂盒，质粒提取试剂盒使用的都是同一批。这个载体送了2个测序结果都没有问题。
两个实验对比，只有酶切-连接构建的这个载体使用的是限制性内切酶，切胶回收的一套（电泳仪，琼脂糖凝胶，电泳缓冲液，蓝光切胶仪），T4连接酶。但是以我的了解这些都不易引起突变。
所以现在找不到问题在哪了，求路过的大神指点，不胜感激！
5 个回答
dxy_tdv6gc82
请问你解决这个问题了吗 我也遇到了🥲
是TTT
- PCR引物设计需检测是否存在发夹结构或二聚体，影响了pcr的特异性。
- PCR反应需严格按照试剂盒说明摸索，退火温度，延伸时间，循环次数不合适，都可能造成错配或缺失。
月亮孩子OHPJ
感谢您的回答！情况是这样的，插入片段是从另一个载体上酶切下来的（这个载体上订购的，已经经过测序验证），不是通过PCR方式获得的。
loveliufudan
原因可能有以下几种：
PCR引物设计不合理，引物内部或两个引物之间存在互补序列，导致发夹结构或二聚体的形成，影响扩增特异性和准确性。
PCR反应条件不适宜，如退火温度过高或过低，延伸时间过长或过短，循环次数过多或过少，都可能造成错配或缺失。
PCR反应体系不平衡，如dNTPs浓度过高或过低，Mg2+浓度不适当，Taq DNA聚合酶活性不稳定或用量不足，都可能影响扩增效率和质量。
PCR模板DNA质量不佳，如含有杂质、抑制剂、甲基化位点等，都可能干扰扩增反应或导致酶切失败。
酶切-连接过程中出现问题，如酶切效果不佳，切胶回收质量差，连接酶活性低，连接体系不合理等，都可能造成突变或假阳性克隆。
月亮孩子OHPJ
感谢您的回答！情况是这样的，插入片段是从另一个载体上酶切下来的（这个载体上订购的，已经经过测序验证），不是通过PCR方式获得的。
后面我尝试更换一个连接酶，看看是否能好一些，再次感谢！
z流沙z
一般可能存在突变的步骤是在pcr这一步，所以应该先排除一下原先模板是否有突变，建议把原先的质粒先测序验证一下
月亮孩子OHPJ
感谢您的回答！情况是这样的，插入片段是从另一个载体上酶切下来的（这个载体上订购的，已经经过测序验证），不是通过PCR方式获得的。
z流沙z
那如果原先的载体质粒没有问题的话，极有可能是感受态的问题，常见的感受态涂板和摇菌是37°，但有一些感受态在37°容易发生重组或者突变，需要用30°
土井挞克树
考虑还是感受态制备过程中造成的突变，制备过程接触的药物，射线都会导致突变
月亮孩子OHPJ
感谢您的回答！同时间用该批感受态细胞也做了另一个载体，那个载体没有突变的情况，不过我后面还是觉得重新制备一批感受态细胞，再试一下。再次感谢～
