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【求助】酶切连接构建的载体测序结果存在突变

相关实验:🔥 分子克隆技术

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月亮孩子OHPJ

求助各位大神有哪些可能造成突变的原因

使用酶切-连接的方式构建载体

插入片段是从另一个已经构建好的载体上切下来的,和骨架载体一起酶切,切胶回收,使用的是蓝光切胶仪,理论上不太可能引起突变

T4连接酶4℃过夜连接。

转化DH5α感受态细胞,涂板。

挑了10个菌落,酶切鉴定后5个阳性,送测序

所有测序结果与预期的序列比对都有单碱基突变,且突变位置不同。与测序公司交流后测序公司表示测序结果没有问题。

该实验期间有用同源重组方法构建的另一个载体(插入片段和载体都通过PCR方式获得),感受态细胞,培养基(抗生素不同),胶回收/产物回收试剂盒,质粒提取试剂盒使用的都是同一批。这个载体送了2个测序结果都没有问题。

两个实验对比,只有酶切-连接构建的这个载体使用的是限制性内切酶,切胶回收的一套(电泳仪,琼脂糖凝胶,电泳缓冲液,蓝光切胶仪),T4连接酶。但是以我的了解这些都不易引起突变。

所以现在找不到问题在哪了,求路过的大神指点,不胜感激!

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5 个回答

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dxy_tdv6gc82

有帮助

请问你解决这个问题了吗 我也遇到了🥲

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是TTT

有帮助
  1. PCR引物设计需检测是否存在发夹结构或二聚体,影响了pcr的特异性。
  2. PCR反应需严格按照试剂盒说明摸索,退火温度,延伸时间,循环次数不合适,都可能造成错配或缺失。
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月亮孩子OHPJuser-title

感谢您的回答!情况是这样的,插入片段是从另一个载体上酶切下来的(这个载体上订购的,已经经过测序验证),不是通过PCR方式获得的。

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loveliufudan

有帮助

原因可能有以下几种:

PCR引物设计不合理,引物内部或两个引物之间存在互补序列,导致发夹结构或二聚体的形成,影响扩增特异性和准确性。

PCR反应条件不适宜,如退火温度过高或过低,延伸时间过长或过短,循环次数过多或过少,都可能造成错配或缺失。

PCR反应体系不平衡,如dNTPs浓度过高或过低,Mg2+浓度不适当,Taq DNA聚合酶活性不稳定或用量不足,都可能影响扩增效率和质量。

PCR模板DNA质量不佳,如含有杂质、抑制剂、甲基化位点等,都可能干扰扩增反应或导致酶切失败。

酶切-连接过程中出现问题,如酶切效果不佳,切胶回收质量差,连接酶活性低,连接体系不合理等,都可能造成突变或假阳性克隆。

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月亮孩子OHPJuser-title

感谢您的回答!情况是这样的,插入片段是从另一个载体上酶切下来的(这个载体上订购的,已经经过测序验证),不是通过PCR方式获得的。

后面我尝试更换一个连接酶,看看是否能好一些,再次感谢!

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z流沙z

有帮助

一般可能存在突变的步骤是在pcr这一步,所以应该先排除一下原先模板是否有突变,建议把原先的质粒先测序验证一下

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月亮孩子OHPJuser-title

感谢您的回答!情况是这样的,插入片段是从另一个载体上酶切下来的(这个载体上订购的,已经经过测序验证),不是通过PCR方式获得的。

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z流沙z

那如果原先的载体质粒没有问题的话,极有可能是感受态的问题,常见的感受态涂板和摇菌是37°,但有一些感受态在37°容易发生重组或者突变,需要用30°

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毛利小五郎的徒弟

有帮助

考虑还是感受态制备过程中造成的突变,制备过程接触的药物,射线都会导致突变

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月亮孩子OHPJuser-title

感谢您的回答!同时间用该批感受态细胞也做了另一个载体,那个载体没有突变的情况,不过我后面还是觉得重新制备一批感受态细胞,再试一下。再次感谢~

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