【求助】请教构建载体

请教构建载体，插于片段670bp，pcDNA3.1质粒5400bp，如果10ul连接体系，插于片段加多少？pcDNA3.1加多少？

pcDNA3.1：片段约为1：3至1：4，其他的成分按照要求来做。

可是我做了1：4加的，长出几个菌，但菌落PCR是阴性的，请教可能什么原因

确认下你的酶切位点；

直接克隆虽然省事，但是还不如先走T载体克隆，然后再连接到你的目的载体上了！

首先，确定一下你的片断浓度，根据你这个片断大小应该不难连接。 注意片断纯化质量， 如果含有乙醇可能不好连接。 重要的是，你应该按照片断的摩尔比去优化，而不是片断的质量比。载体用50ng 应该就足够了，以这个量去计算你加入连接片断的量大概至少需要18.6ng。如果是单酶切的话，可能是载体去磷酸化不彻底，如果是双酶切可能是残余的未完全切割的载体。当然也不排除被污染， 毕竟切胶过程中很容易被污染。

你讲的不是很清楚。

首先你是直接拿pcr产物，做克隆的，还是先做了TA克隆。

先做TA克隆，产率比较高一点。

你所说的插入片段与载体的比例。首先要看它的浓度亮度什么的。

如果你是用单酶切连接的话，建议你适当的提高插入片段的比例。

如果是双酶切的话，比例并不是很重要

片段：载体=1:3

4：1比较好。