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构建载体最后测序乱码怎么办?

相关实验:质粒的制备

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月月年年总相见

我现在是做苹果属里的平邑甜茶,构建PROKII超表达载体和YFPN、C端做BIFC的载体,这些载体都是大约一万四bp,片段是2800bp,我通过同源重组构建载体,用的诺唯赞家的101和505的试剂做菌p,101永远p不出来,我就用505高保真来p,条带出来了,提质粒酶切也跑出来了,一测序就是重叠峰,没信号,特殊结构,直接测序失败,要不就是一比对干脆乱码,真的不知道该怎么办了,球球各位大佬指点我一下,救救孩子吧

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6 个回答

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是TTT

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插入片段有过测序结果吗?是挑的单克隆提的质粒吗?p出来的产物跑的DNA凝胶是单一且很亮的条带吗?有没有杂带或者拖尾呢?

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z流沙z

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如果质粒PCR和酶切都正确的话,那质粒应该是没问题的。有可能是质粒提取纯度不够,混有其他质粒,所以测序有重叠峰。另外一个是质粒或者载体上有特殊结构,测序过不去,可以尝试反向测序,也可以转染细胞进行wb验证。

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weiran0928

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构建好的载体转化到宿主菌后可以直接把菌液送去测序,菌p影响因素太多了,容易失败,测序测全长就行了

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毛利小五郎的徒弟

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考虑是有大量的重叠序列,可以试一试分段测序

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loveliufudan

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您的问题可能涉及到多个方面,以下是一些可能的解决方法:

优化质粒提取和纯化过程:在进行质粒提取和纯化过程时,可能会出现多种问题,例如DNA片段的损失、纯度不够等。您可以尝试使用其他厂家的质粒提取和纯化试剂,或者尝试优化现有的实验步骤,以提高DNA的纯度和质量。

优化PCR扩增条件:您可以尝试优化PCR扩增条件,例如优化引物浓度、缩短扩增时间、降低退火温度等。此外,您还可以尝试使用其他DNA聚合酶,以提高扩增效率和特异性。

检查DNA序列和载体设计:您需要确保DNA序列和载体设计没有问题,特别是与限制性内切酶识别位点有关的问题。您可以使用多个限制性内切酶对载体进行切割,以确认限制性内切酶识别位点是否正确。如果有问题,您可能需要重新设计或合成载体。

检查目的基因的序列:检查您要克隆的基因序列是否存在问题,例如插入缺失、插入反向等。您可以重新合成或重做PCR扩增来解决这些问题。

检查转化实验:如果您已经确定了载体和目的基因序列没有问题,那么您可能需要检查转化实验是否成功。您可以使用其他转化方法或转化菌株来解决这些问题。


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sswei

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原因:所挑选的重组子不是单克隆,所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒;或是是送测序的菌液污染。

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