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T4 DNA Ligase

相关实验:质粒构建技术

最新修订时间:

简介

T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶,可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的 5’-P 末端和 3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合,该催化反应需 ATP 作为辅助因子。

材料与仪器

【材料】DNA片段,引物,限制性核酸内切酶,DNA 连接酶

步骤

1. 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切,一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个,尽量使载体的末端具有特异性,防止自连。 2.根据目的序列构建引物后,引物设计原则简单总结一下: (1)前向引物:5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 1 酶切位点序列+基因正向引物序列 -3’ 端 (2)反向引物:5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切位点序列+基因反向引物序列 -3 ’端 如果目的基因片段较长的话,可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段 3. 载体与目的基因的连接,推荐在 10~20μl 反应体系中进行接反应。 4. 转化 将连接产物转化到受体菌中(一般为 DH5a),涂板,培养过夜。 5. 挑取单克隆,并鉴定 挑去平板上的单克隆培养,可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。

注意事项

1. 载体克隆位点选择尽量选择无重复序列,且 GC 含量比较均匀的区域进行克隆。当克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40%~60% 范围之内时, 克隆效率将达到最大. 2. 最适克隆载体与插入片段摩尔比为 1:2,即最适插入片段使用量为 0.06 pmol。这些摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得: 最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng(0.03 pmol) 最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng(0.06 pmol) 3. 双酶切 1 和 2,在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及 Activity in NEBbuffer 的问题

来源:丁香实验

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