单酶切之后用T4连接酶构载，菌长了满板，pcr验证全是空载。

这个体系是按摩尔比来的么，你测目的基因和载体浓度了么

全是空载的话是不是单酶切后没有载体去磷酸化？载体发生了自连？

证明没有连接上，都自连了，你可以试试载体去磷酸化，插入片段加ATP,看看能不能提高一下连接效率

1.单酶切多切一会儿，跑个电泳看看，加质粒做对照。

2.酶切后加入碱性磷酸酶，防止载体自连。

3.使用新鲜制备的线性载体和片段，调整载体和插入片段的比例试一下。

目的片段没有插入成功，但仍然长出菌落的这个现象可能由于以下原因：

1、抗性失效了

2、插入的片段不够纯

3、有杂菌或被实验室里其他含有抗性的大肠杆菌污染了