多片段无缝克隆一直连不上怎么办？

画好组合成的质粒图，然后一个片段一个片段的对引物，一般这种情况就是引物出问题了。还有就是在连接的时候，你可以把短片段的多放一些。

可能是你的引物序列不正确，你可以在确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。也可能是因为PCR产物不纯，你可以优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物或者换一种纯化方法,纯化您的PCR产物。