质粒载体的粘端DNA连接
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(2)按如下所述设立连接反应混合物:
a.将0.1μl载体DNA转移到无菌微量离心管中,加等摩尔量的外源DNA。
b.加水至7.5μl,于45℃加温5分钟以使重新退炎的粘端解链,将混合物冷却到0℃。
c.加入:10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1μl
T4噬菌体NDA连接酶 0.1Weiss单位
5mmol/L ATP 1μl
于16℃温育1-4小时
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫苏糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白(组分V.Sigma产品)(可用可不用)
该缓训液应分装成小份,贮存于-20℃。
另外,再设立两个对照反应,其中含有(1)只有质粒载体;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足,每个连接反应可用50-100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA,同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商(除New England Biolabs公司外)现在都用Weiss等,11968)对该酶进行标化。1个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化1mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时,1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位(Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位(如New England Biolabs公司所定义)。因此,0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16℃下30分钟内可使50%的λ噬菌体HindⅢ片段(5μg)得以连接。在本书中,T4噬菌体DNA连接酶一律用Weiss单位表示。\par 目前提供的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液(1-5单位/μl),可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20℃保存3个月可保持稳定。
(3)每个样品各取1-2μl转化大肠杆菌感受态细胞。