酶切后DNA连接效率太低是什么原因？

一、目的片段和载体片段的摩尔比很重要，但你的载体片段有多少pmol,应该有一定的pmol数，一般要0.03-0.1pmol，不能太低，不知道你的量有多少。

换一下连接buffer，时间长加上反复冻融会很快失效，建议用新的。

二、载体片段和目的片段的质量也很重要，想一下是否你的回收的质量怎样，是用什么方法得到的，如果质量不好，也是很难得到重组子的。

还有就是确定一下T4连接酶没问题吧

1.双酶切后可以核酸电泳，看看是否切出来了

2.切胶回收纯化目的片断，再连接

3.连接体系的问题，是不是目的片段浓度不够

考虑可能是载体、目的片段回收率不高，连接效率就会低，另外回收片段不要用含盐离子的TE Buffer，也会影响连接效率，直接用纯水。

酶有没有反复冻融导致活性降低？

buffer也应该避免反复冻融，使用时确保完全溶解。

酶切体系中酶的稀释倍数合不合适？

酶和DNA的比例，DNA量过大会抑制酶切效率。

做粘性末端，延长连接时间，插入片段和载体的摩尔比4-10:1

含磷酸盐浓度过高引起的吧，用乙醇沉淀去除磷酸盐试试！

酶切后的DNA片段连接效率低：
1) 含磷酸盐的浓度高
透析，乙醇沉淀去除磷酸盐

2) 内切酶失活不全或含有ATP酶
延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA

3) 平末端连接
加大T4 DNA Ligase用量

4) 外切酶污染
减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA

5) 连接缓冲液不合适
重新配制连接缓冲液