TA 克隆

大部分耐热性 DNA 聚合酶在进行 PCR 反应时都会在 PCR 产物的 3’末端添加一个「A」，而T载体是两侧的 3’端添加了「T」的线性化载体，因此 PCR 产物可以直接与 T 载体进行连接。

构建质粒。

目的 DNA 或者 cDNA、引物、PCR 试剂（天根 KT211）

T 载体（Takara 6011）、琼脂糖、DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒

大肠杆菌、LB 平板和 LB 肉汤培养基、氨苄或者卡那抗生素、质粒抽提试剂盒

(1) PCR：按照 PCR 试剂说明书（天根 KT211），加入目的 DNA 或者 cDNA、引物、PCR 试剂、ddH₂O 等，按照程序进行 PCR 扩增。注意所使用的酶可以在 3’端添加 A。参考体系如下：

程序如下：

扩增完成后，将 PCR 产物按 120 V 30 min 的条件进行琼脂糖凝胶电泳，一般情况下琼脂糖凝胶的浓度为 0.8%~1.0%。在核酸凝胶成像仪中观察目的条带，将目的凝胶切割下来，按照 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，获得目的 DNA 片段。

(2) 连接：按照 T 载体说明书（Takara 6011）进行连接，目的 DNA 片段与载体的摩尔比建议为 3:1 - 6:1，总质量控制在 100~200 ng，4 ℃ 连接过夜或者 16 ℃ 2~3 h。

(3) 质粒转化：从 -80 ℃ 冰箱取出感受态细胞（大肠杆菌，如 DH5α）置于冰上融化，加入连接产物轻轻混匀后放置冰上 30 min，42 ℃ 热激 45 s 后再放置于冰上静置 3 min，在超净工作台中加入无抗 LB 肉汤培养基 500 μL，轻轻混匀放置于 37 ℃ 摇床中 200 rpm 震荡培养 1 h 后，5000 rpm 离心 5 min 收菌，留约 100 μL 上清轻轻吹打混匀，均匀涂布接种于含抗生素的固体 LB 平板中，置于 37 ℃ 培养箱中正放 5 min 使液体被吸收，然后再倒置固体 LB 平板，继续在 37 ℃ 培养箱中培养 12~16 h 左右可出现单个菌落。

（4）质粒提取：挑取单个菌落于 1.5 mL EP 管中，振荡培养 1~2 h 后取一微升作为模板，进行菌液 PCR 验证，观察是否出现目的条带，进一步将上述验证正确的菌液，加入 5~20 mL 含抗生素的 LB 肉汤培养基，37 ℃ 摇床培养过夜（12~16 h），按照质粒抽提试剂盒进行提取，可以再次酶切或者测序验证。

（1）若 PCR 产物不立即回收，应取出放在 4 ℃ 保存（短时间），或者也可琼糖凝胶电泳后切下目的片段条带，贮存于 -20 ℃（可放置时间较长），一般不建议 PCR 产物放置过久，最好直接电泳和回收。

（2）大部分高保真 DNA 聚合酶（如 Pfu DNA 聚合酶），因为具有校正活性，其扩增的 PCR 产物是没有「A」尾的 3’平末端，需要通过加「A」尾程序后才能进行 TA 克隆。

阳性克隆少：可能连接不够充分，建议 4 ℃ 连接过夜，并使用 T 载体自带的阳性对照 DNA 作为阳性对照，以及用 ddH₂O 代替 DNA 作为阴性对照。