Gateway 克隆（BP 反应）

Gateway 克隆属于高效大规模克隆系统，是利用载体上一系列特殊的酶，可以高效、方便、快速地将不同 DNA 序列拼接在一起，将目的基因克隆到受体上用于重组表达载体、RNA 干扰载体、报告基因载体等等。

Gateway 克隆原理基于不同酶的催化反应，能够快速、准确地完成 DNA 序列的切割、转录和接合。其中 BP 反应发生在插入物侧面的 attB 位点和供体载体的 attP 位点之间，BP 克隆酶负责将 DNA 序列从起始载体（Entry Vector）克隆到中间载体（Destination Vector），并产生含有侧翼为 attL 位点的目的 DNA 作为入门载体。

Gateway 克隆技术可以用于构建各种表达载体、RNA 干扰载体和报告基因载体等。通过 Gateway 技术，可以方便快捷地将多个基因片段组合成一个表达载体，从而实现对基因表达的调控、表达定位和功能研究等。

attB-PCR 产物、供体载体、TE 缓冲液、BP Clonase II 酶混合物、蛋白酶 K 溶液、Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1 噬菌体抗性细胞、各种试管、离心机、涡旋仪、冰、培养皿、孔板等。

Gateway 克隆（BP 反应）的操作流程如下：

1、在室温下将以下成分添加到 1.5 ml 试管中并混合：

attB-PCR 产物1–7 µl（=10 ng/µl；最终量~15–150 ng）；

供体载体（150 ng/µl）1 µl

TE 缓冲液 8 µl，pH 8.0

2、冰上融化 Invitrogen BP Clonase II 酶混合物约 2 分钟。将 BP Clonase II 酶短暂涡旋两次（每次 2 秒）。

3、向每个样品（上述步骤 1）中加入 2 µl BP Clonase II 酶混合物，并通过短暂涡旋两次使其充分混合，并离心。

4、将 BP Clonase II 酶混合物储存至 –20 ℃ 或 –80 ℃；25 ℃ 下孵育 1 小时。

5、向每个样品中加入 1 µl 蛋白酶 K 溶液以终止反应。短暂涡旋后在 37 ℃ 下孵育 10 分钟。

6、进行转化：将1 µl 的每个 BP 反应物转化进 50 µl Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1 噬菌体抗性细胞冰上孵育 30 分钟后在 42 ℃ 孵育 30 秒来热激细胞。加入 250 µl S.O.C. 培养基，于 37 ℃ 下振荡孵育 1 小时。分别将 20 µl 和 100 µl 的每次转化产物接种到选择性平板上。

7、预期结果：

如果将整个 BP 反应转化并铺板，则有效的 BP 重组反应将产生 > 1 500 个菌落。

可以使用任何转化效率 > 1.0×10⁸ 个转化子/μg 的感受态细胞。