原理
由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。
材料与仪器
噬菌体 T4 DNA 连接酶 PCR 扩增的靶 DNA T 载体
琼脂糖凝胶 水浴箱
琼脂糖凝胶 水浴箱
步骤
一、材料
1. 酶与缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
2. 凝胶
琼脂糖凝胶
3. 核苷酸与寡核苷酸
PCR 扩增的靶 DNA ( 25 μg/ml)
4. 载体
T 载体
5. 特殊设备
预设水温在 14℃ 的水浴箱
二、方法
1. 在一只微量离心管内，依次加入下列连接混合液：
25 μg/ml 扩增靶序列 DNA 1 μl
T 质粒 20 ng
10X 连接缓冲液 1 μl
噬菌体 T4 DNA 连接酶 3 单位
H2O 补足至 10 μl
2. 将连接混合液在 14℃ 温育 4 h。
3. 将上述两支试管内的连接反应混合液样品各取 5 μl，用 10 μl H2O 稀释后，转化具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化菌液涂布在含有合适抗生素和 IPTG 与 X-gal 的培养基的平皿上。
4. 计算实验组与对照组在培养皿上的菌落数。挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色菌落进行培养扩增，抽提质粒 DNA，利用质粒多克隆位点内的插入外源 DNA 片段侧翼的酶切位点，用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定；也可以直接用菌落 PCR 予以鉴定。
5. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆 DNA 片段的大小（采用合适的 DNA marker分子量作对照）。
6. 利用 DNA 序列分析，限制性内切核酸酶图谱或 Southern 杂交进一步鉴定克隆的靶基因 DNA 片段的正确性。
1. 酶与缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
2. 凝胶
琼脂糖凝胶
3. 核苷酸与寡核苷酸
PCR 扩增的靶 DNA ( 25 μg/ml)
4. 载体
T 载体
5. 特殊设备
预设水温在 14℃ 的水浴箱
二、方法
1. 在一只微量离心管内，依次加入下列连接混合液：
25 μg/ml 扩增靶序列 DNA 1 μl
T 质粒 20 ng
10X 连接缓冲液 1 μl
噬菌体 T4 DNA 连接酶 3 单位
H2O 补足至 10 μl
2. 将连接混合液在 14℃ 温育 4 h。
3. 将上述两支试管内的连接反应混合液样品各取 5 μl，用 10 μl H2O 稀释后，转化具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化菌液涂布在含有合适抗生素和 IPTG 与 X-gal 的培养基的平皿上。
4. 计算实验组与对照组在培养皿上的菌落数。挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色菌落进行培养扩增，抽提质粒 DNA，利用质粒多克隆位点内的插入外源 DNA 片段侧翼的酶切位点，用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定；也可以直接用菌落 PCR 予以鉴定。
5. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆 DNA 片段的大小（采用合适的 DNA marker分子量作对照）。
6. 利用 DNA 序列分析，限制性内切核酸酶图谱或 Southern 杂交进一步鉴定克隆的靶基因 DNA 片段的正确性。
来源：丁香实验
