【共享】做双酶切和连接心得

重组质粒一月有余，颇有心得，与各位战友分享如下：
1：关于双酶切的Buffer，一直是酶切的重点。有人喜欢A酶切完回收再B酶切，其实可以通过NEB网站上查询大部分双酶共切的Buffer问题，常见的双酶搭配甚至可以找一本TAKARA或者其他公司的Catalog，内切酶部分在前面肯定就有双酶切的Buffer推荐表。有些酶没有搭配的推荐，但是有各种酶在L，M，H，K及T+BSA的相对活性，AB两酶选一个合适的即可。注意尤其是T+BSA是较为广泛的universial buffer,一般酶都能保持60%活力以上。但也有个别情况例如Sal I等，也是本人用过的酶，在T+BSA活性低于20%，与Sac I基本上没法在普通Buffer里切，但是可以查到1.5T+ BSA这种特殊Buffer，效果不错。另外如果载体MCS不是太老或者太少的话可以尝试某些同Buffer酶，不必死抠师兄或者文献做法，例如后来第二次用我就重新选了Cla I和EcoR系列，可共用H Buffer，并且Cla I活性是120%。
2：质粒酶切在一开始遇到问题，即试剂盒提取后切一个小时就降解完全，后来经过研究认为是洗脱液的问题，现在试剂盒的Elution Buffer都是TE成分，在酶切时无形中提高了离子浓度（尤其是Ｈ或者1.5Ｔ这种高离子浓度Buffer），导致星号活性而降解质粒。后来用碱法手工提，双蒸水溶解，问题解决。当然另外一个问题是这样做了但酶活力如果觉得比预想的低，则有可能是ＲＮＡ作用，可在酶切时加入ＲＮａｓｅ，不必在提取时就加。事实证明可以提高酶的作用活力。
3：关于片断双酶切：一般人喜欢在引物上加酶切位点，也不错，但我有一次碰到问题是连上载体后用原来引物括不出来了（确定连上了），所以后来是先连pMD18/19T然后再切下来，因为可以保存引物位点（当然引物不能含酶切位点），切得是MCS提供的位点；再后来想了一个更好的办法是用M13-47和RMV引物括了再切（这两个引物在MCS以外），片断浓度大，不需提质粒，没有RNA干扰。注意不是pMD simple而是pMD，前者是没有酶切位点的。
4：连接：这是最痛心的事情，前一阵一个月没连上一个，最近两天连了三个。自己认为片断浓度问题倒是好说，但是必须保证片断的纯度。那一个月迷信ＴＡＫＡＲＡ片断回收试剂盒，方便，但是里面的醇和ＲＮＡ并没有除净；切胶回收就连上了。最近的一个片断引物和条件控制的好，一点引物二聚体都没有，直接连pMD就连上了。得出一个结论就是不要迷信快捷的试剂盒，有时候传统方法也有它无可比拟的好处。当然T4连接酶也要注意不要受热，最好不要偷懒25度连，效果不好，16度比较稳定；最后转载师兄的一个经验，10ul体系内所有片断不要超过100ug，自己倒没注意到这一点。
期盼斑竹加分，另外愿与做微生物基因敲除、群体感应（quorum sensing）系统功能研究的战友交流提高。