【共享】关于连接的一点心得.
丁香园论坛
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前一段时间一直在做酶切连接,特别难连,做了两个月,终于被我揪出来了,现就我所遇到的问题和我自己的摸索,经验,教训,一一列出来,希望对大家有所帮肋.
我做的是酵母双杂交,需构建的是目的片段B接入载体PM中,以及目的片段A接入载体PVP中.其中B 1130bp,A 3760bp.
1.多扩几管,得大量的高保真PCR产物.(多扩几管,因为后面的实验中你会发现每切一次产物越来越少)
2.PCR后进行切胶纯化(这步必须切胶纯化,因为决不可在产物中混入引物,及其它非特异产物)
3.纯化后跑胶,对比marker,知其浓度,一定在酶作用强度内切,如产物太浓,可分两管,每管内多补充一些水,酶切时间可适度延长,我这样采用的是24-30小时,以保证充分酶切,(时间不宜过长,那样会发生非特异酶切).一定要确保酶切完全.
4.酶切后如产物不一定需要切胶纯化,可直接纯化,这样可减少损耗(我前面的实验中,有时候一切胶纯化就几乎不剩什么了)
5.分两次酶切,第二次酶切前也要跑胶看一下浓度.第二次酶切一样也要充分,可以切24小时左右.可以多切几管,不要把一管体系做的很大,可以分10ul一管切,多切几管.
6.载体第二次切完前半小时加CIAP.(防自连)
7.第二次酶次产物可以直接纯化.载体要切胶纯化,加样前要将酶切的管子离心,(因为酶切24小时有一些水被蒸发到管子顶上,如不离心,太少不利加样),可将几管切的,加在一起切胶纯化,这样得到的可供连接用的产物就较多.
8.我这次载体二次酶次后跑胶时出现两条带,我将两条分别切下,连接,最后的实验证明,分子量较小的带后来长出多个克隆,并最终证明连上了;分子量较大的带也可长出克隆,但很少.
9.4度连接36小时,多设几个连接体系.我这次因为两个较难连,每组做了4组体系,最后的结果显示:小片段:载体(摩尔比)1:1,1:3,3:1都有连接上,而大片段:载体(摩尔比)1:1,1:3,3:1中仅1:1连接上,其它比例虽然长出克隆,但是是假阳性.
10.我这次大片段长了25个克隆,(大小片段共长了50个克隆)我把它们全挑出来做PCR了,结果大片段只有三四个真正符合,所以大家要有充足耐心,尽量不要漏掉一个.虽然方法很笨,要真漏了一个结果不可惜了吗:(
11.我这次的实验比较特别,每次单克隆菌落摇菌后,都PCR扩的出来,但酶切切不开.虽然说酶切是金标准,但我的测序结果显示切不开也可以是连接上的.(我的两个引物,一个是载体上的sequencing primer,一个是在片段上),所以不要盲目相信酶切.
以上是我这次实验中的一点感受,啰啰嗦嗦说了一大堆.希望对遇到和我一样的情况(特别难连)的战友一些帮助.
嘻嘻,另外有一个小小的私心,我还没分,如果主任觉得我的贴子还可以,可否加我一分? :~B
我做的是酵母双杂交,需构建的是目的片段B接入载体PM中,以及目的片段A接入载体PVP中.其中B 1130bp,A 3760bp.
1.多扩几管,得大量的高保真PCR产物.(多扩几管,因为后面的实验中你会发现每切一次产物越来越少)
2.PCR后进行切胶纯化(这步必须切胶纯化,因为决不可在产物中混入引物,及其它非特异产物)
3.纯化后跑胶,对比marker,知其浓度,一定在酶作用强度内切,如产物太浓,可分两管,每管内多补充一些水,酶切时间可适度延长,我这样采用的是24-30小时,以保证充分酶切,(时间不宜过长,那样会发生非特异酶切).一定要确保酶切完全.
4.酶切后如产物不一定需要切胶纯化,可直接纯化,这样可减少损耗(我前面的实验中,有时候一切胶纯化就几乎不剩什么了)
5.分两次酶切,第二次酶切前也要跑胶看一下浓度.第二次酶切一样也要充分,可以切24小时左右.可以多切几管,不要把一管体系做的很大,可以分10ul一管切,多切几管.
6.载体第二次切完前半小时加CIAP.(防自连)
7.第二次酶次产物可以直接纯化.载体要切胶纯化,加样前要将酶切的管子离心,(因为酶切24小时有一些水被蒸发到管子顶上,如不离心,太少不利加样),可将几管切的,加在一起切胶纯化,这样得到的可供连接用的产物就较多.
8.我这次载体二次酶次后跑胶时出现两条带,我将两条分别切下,连接,最后的实验证明,分子量较小的带后来长出多个克隆,并最终证明连上了;分子量较大的带也可长出克隆,但很少.
9.4度连接36小时,多设几个连接体系.我这次因为两个较难连,每组做了4组体系,最后的结果显示:小片段:载体(摩尔比)1:1,1:3,3:1都有连接上,而大片段:载体(摩尔比)1:1,1:3,3:1中仅1:1连接上,其它比例虽然长出克隆,但是是假阳性.
10.我这次大片段长了25个克隆,(大小片段共长了50个克隆)我把它们全挑出来做PCR了,结果大片段只有三四个真正符合,所以大家要有充足耐心,尽量不要漏掉一个.虽然方法很笨,要真漏了一个结果不可惜了吗:(
11.我这次的实验比较特别,每次单克隆菌落摇菌后,都PCR扩的出来,但酶切切不开.虽然说酶切是金标准,但我的测序结果显示切不开也可以是连接上的.(我的两个引物,一个是载体上的sequencing primer,一个是在片段上),所以不要盲目相信酶切.
以上是我这次实验中的一点感受,啰啰嗦嗦说了一大堆.希望对遇到和我一样的情况(特别难连)的战友一些帮助.
嘻嘻,另外有一个小小的私心,我还没分,如果主任觉得我的贴子还可以,可否加我一分? :~B
