泛素化连接方式

一般我们明确泛素化连接方式都需要IP+WB，重复验证这样才更稳妥，单独WB出来的结果可信度不高

1. 直接通过WB比较确定泛素化方式有以下局限性:

(1) WB不能明确区分不同连接方式的泛素化。

(2) 泛素化不一定导致靶蛋白降解,连接方式不同对蛋白表达量的影响可能不同。

(3) 需要抑制蛋白酶体活性,否则被泛素化标记的蛋白可能已被降解。

2. IP确定泛素化方式的优势:

(1) 可以分离不同连接方式的泛素化蛋白。

(2) 明确鉴定泛素化部位和类型。

(3) 不依赖于蛋白降解,直接检测标记状态。

(4) 结合质谱可以全面解析泛素化形式。

3. 是否需要加抑制剂:

(1) 如果只检测表达量变化,必须抑制蛋白酶体,否则已降解的泛素化蛋白无法检测。

(2) 如果通过IP检测标记状态,可不用抑制剂。但加抑制剂可以积累样本。

综上,IP配合质谱是确定蛋白泛素化方式的金标准。WB仅评估表达量变化不够确切。抑制剂可选根据实验目的选择是否使用。

泛素含有76个残基，通过羧基端的甘氨酸与靶蛋白赖氨酸的侧链氨基共价结合。泛素之间也可以通过这种方式连接成泛素链。泛素分子中有七个赖氨酸残基，即K6，K11，K27，K29，K33，K48和K63，另外N端的甲硫氨酸也可用于泛素之间的连接，这样就有8种连接方式，各有不同功能。

K48连接最为常见，约占所有连接的50%。K48链主要用于蛋白酶体降解，K11参与内质网介导的降解途径和细胞周期进程的控制，而K29则调控蛋白质的溶酶体降解。K6泛素链在抑制蛋白酶体后未发生富集，表明其可能具有非降解作用。K6泛素链可能与DNA损伤、线粒体稳态等相关。而K27和K33多泛素化可能与先天免疫和免疫反应有关。