蛋白质泛素化分析
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简介
泛素（ubiquitin，Ub）是由 76 个氨基酸组成的 8.6 kDa 的蛋白质分子，在细胞中广泛存在。 它的 C－ 末端的甘氨酸残基提供了 一个与其他蛋白质分子连接的游离羧基，可共价结合在其他蛋白质分子的赖氨酸侧链氨基上，称为泛素化（ubiquitination）。此外，泛素中含有 7 个赖氨酸残基， 其中 Lys－48、Ly－63、Lys - 29 均能通过与另一分子 Ub 的 C－末端连接而形成不同形式的多聚 Ub 链。 结合多个 Ub 时称为多泛素化，单一 Ub 结合即为单泛素化。
用于蛋白质泛素化分析的方法主要有两种：免疫沉淀法用于泛素化分析和 E3 泛素连接酶的活性测定。
原理
蛋白质泛素化分析的基本原理是：细胞内多种蛋白质均可被泛素化系统识别和修饰。泛素化常发生在一些需要被清除的蛋白质分子，或者那些含量在细胞内需要快速调节的分子，例如细胞周期调节蛋白，引导其进入蛋白酶体而被降解（主要由多泛素化介导）。 此外，泛素化也可通过非蛋白质降解的方式参与蛋白质在细胞内的其他调节，如蛋白质的活性、相互作用和细胞内定位。 近来的研究表明，泛素化系统的改变与细胞转化、肿瘤发生、神经退行性疾病、 免疫和炎症反应等有关。
来源：丁香实验团队
操作方法
E3 泛素连接酶的活性测定是用于泛素化分析的一种实验方法。细胞内泛素化最重要的调节酶是泛素连接酶 （E3）。 目前已经鉴定出几百种 E3， 绝大多数 E3 有底物特异性 ，但 有的 E3 也可以识别数种底物。
蛋白质泛素化1、步骤见 Western blot;2、质谱：① 细胞或组织蛋白抽提，非接触式超声破碎；② 泛素化肽段富集（偶联泛素结合结构域 UBD 的磁珠，UBD 结合下的泛素化蛋白在胰蛋白酶的作用下赖氨酸残基被保留）；③ 溶液内蛋白酶切；④ HPLC 肽段分离；⑤ 串联质谱分析；⑥ 泛素化位点数据分析
pd-l1 蛋白的泛素化测定蛋白质泛素化是将泛素分子共价结合到靶蛋白上, 属于蛋白质翻译后修饰，整体流程是先用蛋白质免疫共沉淀技术(co-ip)，获取所需检测的蛋白质，再用泛素化抗体检测该蛋白质的泛素化水平。
