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蛋白质泛素化

相关实验:蛋白质泛素化分析

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审核专家 | 赵玉洁博士

生理学 厦门大学

原理

泛素化修饰是蛋白翻译后修饰方式之一,小分子泛素在一系列酶级联反应包括泛素激活酶、泛素结合酶、泛素连接酶作用下通过共价连接在底物蛋白或目的蛋白上,蛋白底物可以发生单一泛素化、多单泛素化、多泛素化(同型多聚泛素化、异型多聚泛素化),多聚泛素化发生在泛素分子的 7 个赖氨酸残基( Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, and Lys63 ) ,或者 Met1 上,通常情况下与蛋白的降解有关,同时参与基因沉默、细胞周期、免疫应答、转录调控等多种生命活动。

用途

蛋白泛素化状态的识别和泛素化位点的鉴定

Western blot

利用特异的泛素化抗体检测常规样品中的泛素化蛋白,受抗体特异性与灵敏性等限制。

质谱

复杂蛋白混合物中大规模泛素化蛋白的分析、泛素化位点的鉴定。

材料与仪器

1、材料与仪器见 Western blot;

2、质谱-蛋白酶;泛素化蛋白亲和富集磁珠;高级液相色谱仪;质谱仪。

步骤

1、步骤见 Western blot;

2、质谱:

① 细胞或组织蛋白抽提,非接触式超声破碎;

② 泛素化肽段富集(偶联泛素结合结构域 UBD 的磁珠,UBD 结合下的泛素化蛋白在胰蛋白酶的作用下赖氨酸残基被保留);

③ 溶液内蛋白酶切;

④ HPLC 肽段分离;

⑤ 串联质谱分析;

⑥ 泛素化位点数据分析

注意事项

1、通过免疫共沉淀将特定蛋白分离出来后通过免疫印迹的方法可以明确哪个蛋白发生泛素化修饰,多用于初步判断某蛋白的泛素化修饰;

2、体外泛素化进而通过免疫印迹的方法可以明确研究蛋白的哪个赖氨酸残基发生泛素化;

3、质谱可以在多蛋白样本中明确蛋白的泛素化状态和泛素化位点。

常见问题

质谱:

1、用于质谱检测的蛋白溶液中蛋白量的要求:混合蛋白溶液蛋白总量最好不少于 50μg;

2、用于质谱检测的蛋白溶液样品溶剂要求 SDS 含量低于 0.1% ;

3、纯化后蛋白可以直接使用蛋白溶液进行检测吗?

不可以,抗体纯化蛋白未经过 SDS-PAGE 分离,抗体会发生干扰。

来源:丁香实验

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