E3 泛素连接酶的活性测定

相关实验：蛋白质泛素化分析

最新修订时间：2022-02-10

简介

E3 泛素连接酶的活性测定是用于泛素化分析的一种实验方法。细胞内泛素化最重要的调节酶是泛素连接酶（E3）。目前已经鉴定出几百种 E3，绝大多数 E3 有底物特异性，但有的 E3 也可以识别数种底物。

原理

E3 泛素连接酶活性测定的基本原理都是检测体外泛素化反应，可采用两种方式，一种是测定 E3 的自我泛素化，另一种是用专门的蛋白（例如核酸酶 S 肽）作为泛素化底物来测定目的蛋白（可以 GST 融合蛋白形式表达纯）是否具有 E3 酶活性。

材料与仪器

试剂：

1、5x 泛素化反应缓冲液： 250 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）， 12.5 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L DTT， 10 mmol/L ATP

2、 E1 泛素激活酶

3、 E2 泛素结合酶

4、泛素

5、 2 x SDS－PAGE 上样缓冲液

步骤

E3 泛素连接酶的活性测定用于泛素化分析的基本过程可分为如下几步：

A、在每一反应管内加入：4 微升 5X 泛素化反应缓冲液，1.5 ug 纯化 GST－融合蛋白（待检测 E3 活性的蛋白质），1.5 ug 核酸酶 S 蛋白（底物），100 ng E1 泛素激活酶，500 ng E2 泛素结合酶，2.5 ug 泛素，H2O 补足体积至 20 ul。对照反应管内可分别去除上述反应的各个成分。

B、室温反应 1.5 h 以上。

C、加入 20 ul 2 x SDS－PAGE 上样缓冲液终止反应， 95 °C 5 min。

D、进行 SDS－PAGE，转移至 PVDF 膜。

E、用抗 Ub 抗体进行免疫印迹检测。

来源：丁香实验