泛素化实验怎么做呀

具体步骤：

主要有两步：第一步，泛肽激活酶、泛肽载体蛋白、泛肽-蛋白连接酶共同作用下，将泛肽C端的羧基与底物蛋白的赖氨酸残基的ε氨基形成异肽键，后续泛肽以类似的方式连接成串，完成对底物蛋白的多泛肽化标记。

第二步，多泛肽化标记的底物蛋白被26S蛋白酶体迅速降解称成为小肽片段，再由其它肽酶水解为游离的氨基酸。

泛素化步骤：

1.突变和荧光标记的构建

首先，需要构建带有突变或荧光标记的泛素和底物蛋白

2.固相分析

需要进行固相分析，以评估底物蛋白的泛素化修饰水平。这通常涉及在一个固相上固定底物蛋白，并向其添加泛素化酶和泛素化反应所需的其他材料。底物蛋白和泛素可以在体外或体内进行泛素化修饰。然后，用特定的抗体或荧光探针检测泛素化修饰水平。

3.在体修饰

此外，可以进行在体修饰，以评估底物蛋白在细胞内的泛素化修饰水平。这通常涉及将带有荧光标记的底物蛋白转染到细胞中，然后在不同条件下进行培养，以评估泛素化修饰的水平。例如，在添加特定抑制剂的情况下，其影响底物蛋白的泛素化修饰水平等。

以下是一种常见的蛋白泛素化实验的步骤，供参考：

1. 准备实验材料：

• 目标蛋白

• 泛素连接酶（E3酶）

• 泛素（Ubiquitin）

• ATP（三磷酸腺苷）

• 缓冲液（例如Tris-HCl缓冲液）

2. 准备反应体系：

• 在离心管中配制反应体系，根据实验需求确定反应组分的浓度。一个简单的反应体系可以包含目标蛋白、E3酶、泛素和ATP等组分。

3. 设置反应条件：

• 确定合适的反应温度、时间和pH值，这些条件可能因具体实验而有所不同。一般来说，37°C是常用的反应温度，而反应时间可能在几分钟到几小时之间。

4. 反应控制：

• 可以添加特定的抑制剂或突变蛋白等来控制反应的特异性。例如，添加特定的抑制剂可以阻断泛素连接酶的活性，以确定泛素化是由特定的E3酶介导的。

5. 进行反应：

• 将反应体系置于合适的温度下，让反应进行一段时间。

6. 反应停止：

• 停止反应的常见方法是通过加入SDS-PAGE样品缓冲液，可以使蛋白变性并停止反应。

7. 蛋白分析：

• 使用相应的方法来分析蛋白的泛素化状态。常见的方法包括免疫印迹（Western blotting）、质谱分析等。例如，可以使用特定的抗体来检测目标蛋白是否被泛素化。