pd-l1 蛋白的泛素化测定

蛋白质泛素化是将泛素分子共价结合到靶蛋白上, 属于蛋白质翻译后修饰，整体流程是先用蛋白质免疫共沉淀技术(co-ip)，获取所需检测的蛋白质，再用泛素化抗体检测该蛋白质的泛素化水平。

蛋白质的泛素化水平检测是利用抗原-抗体相互作用来检测某个蛋白的泛素化修饰水平的实验，需要用 IP 级抗体与细胞裂解液孵育过夜形成抗原-抗体复合物，再用琼脂糖珠子耦联抗原-抗体复合物，最后将抗原洗脱下来，此抗原就是待检测的蛋白，最后通过 WB 实验，敷泛素化抗体进行检测。

泛素化能够调控蛋白质稳定性、定位、活性，并参与转录调节、DNA 损伤修复、细胞周期、凋亡以及囊泡运输等生理过程。

试剂和耗材：

实验组和对照组细胞、NP40 裂解液

coctail、ProteinG-sepharose 珠子

预冷的 PBS、PD-L1 抗体

5×loading buffer、RIPA 裂解液

Ubiquitin 抗体

仪器：

高速离心机、旋转子

WB 所需仪器（电泳仪、制胶板、电泳槽、成像仪等）

PD-L1 蛋白的泛素化水平检测流程如下：

1、提取蛋白：实验组和对照组细胞分别用 NP40 加 coctail 在冰上裂解细胞 30~60 分钟，收集细胞裂解液，超声后，4 ℃ 1200 g 离心 20 分钟，取上清。

2、去除非特异性杂蛋白：取实验组和对照组细胞裂解液上清各 1.2 mg，各加入 ProteinG-sepharose 珠子 20~30 ul，并用 PBS 补齐样品至总体积 500 ul，4 ℃ 旋转过夜。

3、加入 PD-L1 抗体：上述样品 4 ℃ 1200 g 离心 15 分钟，取上清，各加入 PD-L1 抗体 4 ug，4 ℃ 旋转过夜。

4、洗 ProteinG-sepharose 珠子，步骤如下：准备两支 ep 管，各取 ProteinG-sepharose 珠子 30 ul，各加入 200 ul PBS，上下颠倒 10 次以后，4 ℃ 1200 g 离心 5 分钟，弃去 PBS，重复三次。

5、耦联 ProteinG-sepharose 珠子：取步骤 3 中的样品短暂离心后，分别加入步骤 4 中的两个 ep 管中，4 ℃ 旋转过夜。

6、蛋白洗脱：上述样品 4 ℃ 1200 g 离心 15 分钟，取沉淀 ProteinG-sepharose 珠子，各加入 200 ul PBS，4 ℃ 旋转 10 分钟，然后 4 ℃ 1200 g 离心 5 分钟，取沉淀 ProteinG-sepharose 珠子，重复三次。

7、变性分离：上述沉淀 ProteinG-sepharose 珠子，各加入 12 ul 5×loading buffer 和 18 ul RIPA，震荡 1 分钟，短暂离心，100 度变性 10 分钟，常温 1200 g 离心 5 分钟，取上清，此为 WB 样品。

8、WB 检测泛素化水平：制备 1.5 cm 厚 10 孔的胶，取上述样品进行 WB 实验（可参考丁香实验的 Western blotting 步骤)。

不同的是，检测 PD-L1 蛋白的泛素化水平不同于溴酚蓝跑到电泳槽底部，而是等 40 kd 处（待检测蛋白的分子量，这里为 PD-L1 蛋白）这一水平线跑到电泳槽底部结束。

同时，泛素化是一条很长的条带，故裁剪膜的时候需从 40 kd 裁至 130 kd，敷泛素化抗体。

1. NP40 使用前可 37 度加热 5 分钟，加速蛋白降解，使蛋白停留在泛素化阶段。有些泛素化差异明显的蛋白，不须加热也能有差异。

2. coctail 在 NP40 加热以后加入细胞前再加入。

3. 泛素化的样品总量至少有 30 ul，故起始电压要小，30 v 起跑，以免样品冲出样品孔，15 分钟以后加大电压至 60~80 v，待 marker 分开以后加大电压至 100~120 v。

4. 跑泛素化时转膜时间需适当延长。

1. 样品差异不大：实验结果在没有差异的时候，需要排除 co-ip 条件不一致，例如加入的珠子量是否存在差异等；如果差异仍然不明显，那么可以减少蛋白裂解液的量至 1 mg。

2. 泛素化条带不均匀：调整下层胶的浓度，使泛素蛋白在目的范围内分开来，便于更好观察差异。