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连接介导的单侧PCR

相关实验:用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR实验

最新修订时间:

原理

材料与仪器

0.4μg μL溶于pH 7.5的TE缓冲液的经打断的基因组DNA
​ 第一链合成混合物 含有寡核苷酸引物I 20μmol L单侧接头混合物 连接酶稀释液 连接酶混合物 2000 〜3000 Weiss 单位 mL T4 噬菌体 DNA 连接酶 用于沉淀的盐混合物 100%乙醇 冰冷和室温 75%乙醇 室温 扩增混合物 含有接头引物和引物2 2 U μL Vent DNA聚合酶混合物
1.5 mL硅化微量离心管 带管扣(可选) 4°C和17°C水浴锅 自动热循环仪

步骤

1) 将5μL (2μg)打断的基因组DNA加入到一个硅化的1.5 mL微量离心管中,冰水浴放置数分钟。剪切的DNA样品必须干净,如果DNA中混有其他污染物(如哌啶)将干扰反应。从6×105个基因组(3×1O5个双倍体细胞核)出发可得到高质量、重复性好的足迹分析及测序反应。这相当于2μg小鼠(哺乳动物)基因组DNA。对于其他的物种,一般单倍体基因组数至少为6 ×105,但是不同的基因组大小会导致相对应的DNA绝对量不同。


2) 准备含引物I的第一链合成混合物,并于冰水浴上冷却数分钟。25μLDNA样品中,用移液器轻轻混匀,将样品再置于冰水浴中,样品管加上管扣以防在加热变性时管子爆开。


3) 将DNA在95℃变性5 min,引物在60℃复性30 min,然后76℃延伸10 min。正在合成第一链时,可以按步骤4准备溶液。第一链的合成在自动热循环仪上能很容易地自动进行,也可以手工在不同的水浴间转移。为了降低背景,应该使复性温度高于Tm值2℃左右,并且在76℃进行延伸。延伸步骤可以产生一个用于以后连接反应的平端(图15. 3.1)。


4) 在冰浴上融化20μmol/L的单侧接头混合物。配制连接酶稀释液,并配制不完整的连接酶混合物,但在步骤6前先不要加入接头及连接酶,所有液体均放置于冰水浴。


5) 当步骤3中的延伸反应完成时,立即将样品放至冰浴,4℃稍加旋转离心以收集冷凝液滴,再置于冰水浴。


6) 将步骤4准备好的不完整连接酶混合物中加入连接酶,混匀;再加入接头,混匀;放置于冰水浴。


7) 往样品中加入20μL配制的连接酶稀释液,用移液器轻轻混匀,放置于冰水浴。加入25μL步骤6准备好的连接酶混合物,用移液器轻轻混匀,再放置于冰水浴上。4℃稍加旋转离心,17℃水浴过夜。


8) 样品置于冰水浴数分钟,4℃稍加旋转离心,再置于冰水浴。


9) 准备好沉淀盐溶液。往样品中加入9.4μL用于沉淀的盐混合物和220μL预冷的100%乙醇,颠倒混匀,-20℃下至少放置2 h。


10) 4℃离心15 min沉淀连接反应物,弃上清。


11) 加入500μL 75%室温乙醇颠倒几次清洗管壁及沉淀,室温下离心5 min,弃上清。 用移液器吸去痕量乙醇液滴,晾干或者用Speedvac真空旋转蒸发器蒸发残存的乙醇。


12) 加入70μL水并将样品置于室温以溶解沉淀,偶尔在涡旋混合器上振荡以促进溶 解。每次振荡完毕,可离心2〜3 s,以收集液滴。当沉淀溶解之后(通常<30 min),将样品置于冰水浴上冷却。当溶解沉淀的时候,可以准备和预冷含有 接头引物和引物2的扩增反应液。


13) 往样品中加入30μL预冷的扩增反应液,用移液器轻轻混匀。样品再置于冰水浴。


14) 往样品中加入3 μL (1 U) Vent DNA聚合酶混合物,用移液器小心混匀。将样品再置于冰水浴。该反应对所用的Vent DNA聚合酶的用量十分敏感,过量的聚合酶会导致很高的背景。


15) 加入90μL 矿物油覆盖样品,4℃稍加旋转离心,将样品再置于冰水浴。


16) 进行18个PCR循环。第一步变性应为95℃ 3〜4 min,随后的变性反应可为


1 min;引物复性温度应高于Tm值0〜2℃ (如果引物2和接头引物:Tm值不同,取较低的Tm值);76℃延伸3 min,每个循环的延伸步骤另补加5 s;最后一步延伸 10 min。反应完毕,将样品置于冰水浴,取下管扣(如果使用的话),4℃稍加旋转离心,收集冷凝液滴。将样品置于冰水浴。


本步骤中最重要的参数就是变性温度。如果温度太低就会发现没有信号或序列梯度缩短,如果温度太高就会使聚合酶失活。


17) 准备含有标记引物3的末端标记混合物,置于冰水浴中预冷数分钟。取5μL加入样品中,用移液器温和混匀水相时,样品管应尽可能多地置于冰水浴中,4℃稍加旋转离心,再置于冰水浴


注意:标记混合物含相当大量的32P,操作和弃置样品及混合物时应格外小心。


18) 进行两轮PCR以标记DNA。第I次变性反应为95℃ 3〜4 min;第2次变性为 95℃1 min。末端标记引物3的复性温度应高于其计算的Tm值0〜2℃,复性2 min;76℃延伸10 min。当第2个延伸反应结束时,将样品放置于冰水浴。


19) 将样品置于室温,然后迅速加入295μL VentDNA聚合酶终止液,在涡旋混合器上振荡混合,稍加旋转离心,以收集粘在管壁和顶部的放射性液滴。加入500μL 酚/氯仿/异戊醇,用力摇匀或振荡混合。室温离心3〜5 min。将上层水相(约 400μL,避免混入界面物质)转移到一个干净的经硅化的1.5 mL微量离心管中, 充分混匀,稍加旋转离心,收集管壁上的液滴。


20) 准备4个干净的经硅化的1.5 mL微量离心管,每管中加入235μL室温100%乙醇 和94μL水相,在涡旋混合器上振荡以充分混匀。-20℃放置至少2 h。弃去所有剩下的水相。


21) 将沉淀样品在4℃离心15 min,弃上清。


22) 加入500μL室温75%乙醇,在涡旋混合器上振荡。样品在室温离心5 min,弃上清。用移液器吸去痕量乙醇,然后晾干或用Speedvac蒸化器蒸发残余的乙醇。


23) 每管中加入7μL加样缓冲液,室温放置,偶尔在涡旋混合器上振荡以帮助溶解沉淀,每次振荡后,可稍加旋转离心2〜3 s,以收集管壁上的液滴。样品一般很快就溶解(5 min以内)。可用一根吸管从中吸出液体检査样品是否已完全重悬,并用盖革计数器确定放射性是在样品里而不是留在管里,将样品再放回原管。如果仍有大于总放射量的10%留在管里,振荡,离心,重复上述操作。


24) 将样品在85〜90℃变性5 min后,将每管中全部样品加样于6%测序胶上进行电泳,电泳完毕固定并干燥胶,然后不加增感屏放射自显影6〜24 h。因为加入了 25 bp的接头,测序梯级应比原始的足迹或测序产物长25 bp。

注意事项

本节中所有使用的试剂都应该是新鲜配制的高纯度试剂,而且所有的溶液均需用在玻璃蒸发器中获得的蒸馏水配制。

常见问题

其他试剂:

矿物油,末端标记混合物 含有末端标记的引物3 ,Vent DNA聚合酶终止液 25:24:1 (V/V/V)酚/氯仿/异戊醇,加样缓冲液


来源:丁香实验

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