从单层细胞制备用于DMS足迹分析的基因组DNA

1) 在实验前先准备好以下溶液：在置于通风橱的37℃水浴中预热的PBS(约75 mL/ 15 cm培养皿）；将每份24 mL细胞培养液加入到50 mL的一次性使用螺口聚丙烯管中，与PBS—样在37℃水浴预热。配制裂解液。

2) 对于对照（未处理的）细胞：弃去15 cm组织培养皿中的培养液，迅速加入约25 mL 预热的PBS，轻轻晃动几次，倒掉PBS。立即进行步骤5。

3) 对于体内DMS处理细胞：弃去15 cm组织培养皿中的细胞培养液。取24μL 100% DMS加至每份预热的培养液中（DMS终浓度0.1%)，旋上盖子，倒转几次以混匀，然后将全部液体加入到组织培养皿中，让含0.1 % DMS的培养液与细胞接触恰好 2 min。

临用前才加入DMS,培养液中的水会很快使之失活。可通过调整温育的时间和（或）DMS的浓度，以得到最适的DMS足迹。

4) 用带废液瓶的抽气装置，吸出并弃去含0.1% DMS的培养液。轻轻地加入约25 mL 预热的PBS于细胞培养皿中，轻轻混合几次，然后吸去PBS。用预热的PBS如此反复洗培养皿3次，每次PBS在细胞上应停留30 s左右。

5) 对于处理的和未处理的细胞：尽量吸尽PBS,然后加入1.5 mL裂解液，轻轻摇动使裂解液均匀地布满整个细胞层的表面，室温放置约5 min。

6) 倾斜培养皿，然后用一次性细胞刮子将DNA细胞裂解液刮下，用吸管尽可能将裂解物全部转移至1个15 mL聚丙烯管中。

7) 细胞裂解液在37℃温育3〜5 h,每隔30〜60 min混合1次。温育过程中，用蛋白酶K消化细胞蛋白质。结束温育后，样品可在-20℃无限期储存，在使用之前应先融化并使其温度至室温。

8) 加入1.25倍体积的缓冲液平衡酚，轻轻颠倒30次充分混匀。在台式离心机上室温 1300 g (在 IEC Centra-7R 离心机上为 2500 r/min)离心 10 min。用23 cm 的巴斯德吸管穿过水相和界面插至管底，吸去底层的酚。如果黏性的DNA被带至有机相，可用吸头吹出空气气泡而使其分离。不要触动界面，因为在界面处有许多DNA。用酚重复抽提1次。

9) 加入1倍体积酚/氯仿/异戊醇，轻轻颠倒约30次充分混匀。室温500 g (在IEC Centra-7R离心机上为1500 r/min)离心10 min,如步骤8用23 cm的巴斯德吸管头从底部吸走酚/氯仿/异戊醇。勿触动界面，重复此抽提步骤1次。

10) 加入1倍体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒约30次充分混匀。室温200 g离心5 min, 如步骤8用巴斯德吸管从底部吸走氯仿/异戊醇溶液。

11) 加入1倍体积乙醚，轻轻颠倒约30次重复混匀。通过重力作用使其分层（约 1 min),用一根巴斯德吸管吸取乙醚（上相），在通风橱中使所有残余的乙醚完全 挥发（约5 min)。

12) 加入1倍体积异丙醇，轻轻颠倒约30次使其混合完全。

13) 将纤维状的DNA沉淀缠绕在已封堵的23 cm长的巴斯德吸管上或细玻璃棒上，小心地从异丙醇溶液带出，将DNA轻压试管内壁使多余液体流去。

14) 将缠绕着的DNA置于3 mL pH 7.5的TE缓冲液，室温下轻轻摇数小时至过夜使 DNA重新溶解。

15) 加入330μL 3 mol/L乙酸钠和6.7 mL冰冷的100%乙醇，轻轻颠倒约30次充分混匀。如步骤12和13，重新沉淀和缠起DNA。

16) 将缠绕着的DNA置于200〜500μL pH 7.5的TE缓冲液，室温放置过夜或4℃放置数天，在此过程中不时地轻轻颠倒几次，使DNA重新溶解。溶解完全后，用分光光度计测定DNA浓度，并将其浓度调为0.5〜1 mg/mL，储于4℃。对照DNA (没有用DMS处理）质量应较高，此时可用于基因组测序和基因组甲基胞嘧啶分析（Garrity and Wold，1992)。

17) 将约75〜175μL对照DNA加入到一个硅化的1.5 mL微量离心管中，加入TE缓冲液至175μL

18) 在495μLH2O中加入5μL100% DMS得到1% DMS溶液,振荡25 s充分混匀， 稍加旋转离心，收集液滴。DMS应试几个不同的浓度，以确定与用于步骤3和4的体内条件最为匹配的条件。

19) 加入25μL1% DMS溶液于对照DNA中，轻轻颠倒约25 s充分混匀。避免DMS 溶液粘在管盖上，如有黏附，可稍加旋转离心。室温温育恰好2 min,然后加入50 μL冰冷的DMS终止缓冲液。立即加入750μL在干冰上预冷的100%乙醇，剧烈摇动使其混合，将管子插入碎干冰中，让样品在干冰上放置约30 min。

20) 与体外DMS处理的样品平行，制备经体内处理的DNA待哌啶处理。将200μL DNA (来自步骤16)与50 冰冷的DMS终止缓冲液混合，在涡旋混合器上稍加振荡（3 s)。加入750μL冰冷的100%乙醇，剧烈摇动混合。将管子插入干冰中，让样品在干冰上放置约30 min。

21) 将两种DNA沉淀样品（来自步骤19和20)4℃离心l0 min，弃上清。将沉淀加入1 mL室温的75%乙醇，在涡旋混合器上稍加振荡（5 s)直至沉淀离开管壁。4℃离心10 min,弃上清。

22) 用水按1:10稀释哌啶至终浓度为1 mol/L，往每种DNA沉淀中加入200μL。室温下温育以重溶DNA，并间或在涡旋混合器上振荡。沉淀通常可在15 min左右溶解。仔细检查样品确定DNA已完全溶解，没有溶解的沉淀在1 mol/L的哌啶中会形成小透镜状的清晰漂浮物。注意：应在通风橱中分装哌啶。

23) 当沉淀已完全溶解，稍加旋转离心以收集液滴。扣上管扣，在通风橱中于90℃加热 30 min。用哌啶加热处理可以使基因组DNA在甲基化的鸟嘌呤处断裂，使DNA变性并破坏污染的RNA。

24) 打开管扣，稍加离心以收集冷凝液滴。置样品于干冰上冷却10 min。用Speedvac 真空旋转蒸发器在室温蒸发1〜2 h,除去哌啶。

25) 沉淀用360μL pH 7.5的TE缓冲液重悬。加入40μL 3 mol/L pH 7.0的乙酸钠，在涡旋混合器上振荡混匀；加入1 mL冰冷的100%乙醇，剧烈摇动以充分混匀，-20℃至少放置2 h以上。

26) 样品在4℃离心15 min，弃上清。沉淀用pH 7.5的TE缓冲液500μL重悬，加入 170μL 8 mol/L乙酸铵，在涡旋混合器上振荡混匀；加入670μL异丙醇，剧烈摇动以充分混匀，-20℃放置至少2 h。

27) 样品在4℃离心15 min,弃上清。加入500μL室温的75%乙醇，在涡旋混合器上 振荡，样品在4℃离心15 min，弃上清，并用吸管吸去残余的痕量乙醇。

28) 沉淀用50μL水重悬，然后在Speedvac蒸发器中干燥1 h。重新溶解沉淀于TE缓冲液中，使DNA终浓度约为1μg/mL。

29) 样品在室温离10 min,将上清液转移至一个新的经硅化的微量离心管中，如有胶状沉淀存在，弃去。用分光光度计对DNA定量，并用pH 7.5的TE缓冲液将浓度调至0.4μg/μL,此时的样品可用于连接介导PCR。

其他试剂：

乙醚，异丙醇，TE缓冲液，pH 7.5 ，3 mol/L 乙酸钠，pH 7.0，100%乙醇，室温或干冰冷却，75%乙醇，室温，冰冷的DMS终止缓冲液，哌啶，8 mol/L乙酸铵