PCR 技术

实时荧光定量 PCR-FP

不必提取目的基因 DNA，不必酶切鉴定，直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增与鉴定。

定量甲基化特异性 PCR（quantitative methylation specific PCR, qMSP）是一种用于检测 DNA 甲基化程度的分子生物学方法，可测定 DNA 特定位点甲基化状态的百分比，适用于描述甲基化在基因表达中的作用以及疾病发生发展的分子生物学机制研究等领域。

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提取样本单细胞核后，分离并标记细胞核，在单细胞水平检测核基因表达情况的技术。

DNA 序列的化学合成为基因在异源系统中的高水平表达和功能研究提供了强有力的工具。近年来，已经发展了许多 DNA 序列的合成和收集的方法。早期的方法主要是酶的连接和 FokI 方法，后来自身引发 PCR、PCR 集合和模板定向连接技术发展了起来，最近又报道了长 DNA 序列的合成和收集方法，其中典型方法有基于 PCR 热力学平衡的翻转方法 (thermodynamically balanced i

2005 年，Margulies 等人在「Nature」上发表文章介绍了一种快速简单的测序方法：即以 DNA 扩增的乳胶系统 (emulsion system) 和皮升大小焦磷酸 (pyrophosphate) 为基础的测序方法——焦磷酸测序 (pyrosequencing) 方法。这种测序方法比传统的 Sanger 测序的方法快 100 倍, 假如利用这种方法来进行人类基因组的测序，那么在 10

自从 Sanger 等 (1975) 引入双脱氧核昔三磷酸 (ddNTP) 作为链终止剂，DNA 序列测定技术得到迅速发展。目前，用于 PCR 测序的方法主要有 2 种：直接测序法和循环测序法。

Gyllensten 等在 20 世纪 80 年代末发明了一种新的方法扩增单链的 DNA用于 DNA 的序列测定，这就是不对称 PCR (asymmetric polymerase chain reaction)，它指的是利用不等量的一对引物来产生大量的单链 DNA (ssDNA) 的方法。目前，用于不对称 PCR 实验的方法主要有 3 种：引物浓度不对称 PCR、常规热不对称 PCR 和交错式热

甲基化特异PCR (methylation-specific PCR，MS-PCR) 是一种特异位点甲基化检测技术，是研究 DNA甲基化最为常用且准确度较高的方法之一。目前用于甲基化特异PCR的方法主要有1种：甲基化特异PCR。

定量PCR是指以一种标准作对照，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量进行定量的技术。根据原理的不同，目前主要采用的定量PCR方法包括极限稀释法、设立内参照物的定量PCR、荧光定量 PCR （fluorescence quantity PCR，FQ-PCR）等。其中荧光定量PCR是最新发展起来的一项定量PCR技术。

原位 PCR（in situ PCR）就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，在分子和细胞水平上检测特定的基因组序列、转基因及外源基因，对研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值，在分子生物学、细胞学、分子病理学及临床诊断领域里具有巨大的应用前景。根据操作方法的不同，原位PCR可分为间接法和直接法。直接法操作步骤较少，但具

反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量的RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

限制性片段长度多态性 PCR，是理论依据是首先利用 PCR 扩增目的基因，然后用限制性内切酶酶解样品 DNA，产生大量的限制性酶切片断。将限制性酶切产物进行含有漠化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下即可分辨各种限制性片段的大小及其位置。或者将限制性酶切产物与探针杂交进行放射自显影，从而区分各种片段。由于目标 DNA 之间存在有同源性和变异性，当用同一种限制性内切酶酶解不同品种或同一品种的不同个体

PCR-变性梯度凝胶电泳，是把 30~50 个 GC 碱基组成的核苷酸链加在其中一条引物的 5' 端，通过 PCR 扩增目的基因，使扩增产物的一端含有 GC 碱基即 GC-clamp。由于 GC-clamp 为扩增片段中 Tm 值最高的区域，而其它部分因所含碱基的种类不同，其 Tm 值也不同，而且明显低于最高 Tm 值。将带有 GC-clamp 的 DNA 片段放入变性剂（尿素和甲酰胺）呈线性梯度

同源一步荧光等位基因特异性 PCR，是利用含有大量吸收单元的水溶性共轭聚电解质（water-soluble conjugated polyelectrolytes，CP），激发能量沿着 CP 的骨架转移到发色团报告物，导致荧光信 号的扩增。将等位基因特异性 PCR 与利用 CP 检测联合起来。目前，用于同源一步荧光等位基因特异性 PCR 的方法主要有 1 种：同源一步荧光等位基因特异性 PCR。

低温变性共扩增 PCR，是不管突变存在于什么位置，均能从野生型和含突变的序列的基因混合物中选择性扩增出为数不多的等位基因的方法。目前，用于低温变性共扩增 PCR 的方法主要有 1 种：低温变性共扩增 PCR。

L-DNA 标记的等位基因特异性 PCR，是将等位基因特异性 PCR 与 L-DNA 标记的 PCR 结合起来。L-DNA 标记的 PCR 扩增的 DNA 是带有序列确定的 L-DNA 标签。L-DNA 是自然存在的 D-DNA 的对映体，由 L-2' 脱氧核昔酸组成。单链 L-DNA 能够与 L-DNA 互补，但不与 D-DNA 互补，由于大分子的手性，自然界的酶如核酸酶、聚合酶也不能对 L-D

简单等位基因辨别 PCR，在基于扩增阻碍突变系统（amplifi-cation refractory mutation system，ARMS）原理的基础上设计引物，如果引物和对应的非靶 向模板之间配对，那么在引物 3'末端倒数第二个碱基处引入一个额外的错配碱基，这种方法被命 名为简单等位基因辨别 PCR（simple allel-discriminating PCR，SAP），与 CAPS 相比

等位基因特异性 PCR，也称错配 PCR（mismatch PCR）， 扩增耐突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）， 错配扩增突变分析（mismatch amplification mutation assay，MAMA），是相较单链构象多态性分析（single stnmd conformation polymorphism，SSC