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简单等位基因辨别PCR

实验分类:

PCR 技术

别名:

simple allel-discriminating PCR, SAP

最新修订时间:

简介

简单等位基因辨别 PCR,在基于扩增阻碍突变系统(amplifi-cation refractory mutation system,ARMS)原理的基础上设计引物,如果引物和对应的非靶 向模板之间配对,那么在引物 3'末端倒数第二个碱基处引入一个额外的错配碱基,这种方法被命 名为简单等位基因辨别 PCR(simple allel-discriminating PCR,SAP),与 CAPS 相比较,这种方法简单、成本低、功能强大而且可靠性高。目前,用于简单等位基因辨别 PCR 的方法主要有 1 种:简单等位基因辨别 PCR。

原理

简单等位基因辨别 PCR 的基本原理是为了辨别野生型和突变型等位基因间的碱基变化,在 SAP 分析中设计的一个上游引物只与 野生型配对,另一个上游引物只与突变型配对,这两个等位基因特异的引物分别与一个下游引物进行标准的 PCR 反应。引物设计基于这样的原则:如果 SNP 错配在等位基因特性引物和非模板 的靶序列之间会导致较弱的不稳定,就在引物 3' 末端倒数第二个位点引入一个强的不稳定错配。相反,如果 SNP 错配已有很强的不稳定效应,就应当在倒数第二个位置引入一个较弱的不稳定错配。如果在 SNP 错配处存在中等强度的不稳定效应,就在倒数第二个位置引入一个较弱或中等强度的错配。

设计等位基因特异性引物时,在引物 3' 末端倒数第二个位置引进的碱基应当根据表 14-2 来决定。图 14-4 (a) 说明了检测 seu-1 基因突变体引物设计的步骤。在这个例子中,末端错配是弱不稳 定的 (G-T,A-C),因此在引物 3'末端倒数第二个位置引入强不稳定错配 (G-A)。在图 14-4 (b) 中,假设基因由 C 突变为 A, 由于末端错配 (G-A 和 T-C) 是强不稳定的,从而在倒数第二个位置 引入一个弱不稳定的错配 (T-G),① 显示了 WT 引物与 WT 模板正确的配对,PCR 能够进行:② 显示了 MT 引物与 MT 模板稳定的配对,PCR 正常进行;③ WT 引物与 MT 模板的不稳定配对,由于连续两个错配,PCR 不能进行;④ 引物与 WT 模板的不稳定配对,PCR 不能进行。

来源:丁香实验团队

操作方法

简单等位基因辨别PCR

简单等位基因辨别 PCR,在基于扩增阻碍突变系统(amplifi-cation refractory mutation system,ARMS)原理的基础上设计引物,如果引物和对应的非靶 向模板之间配对,那么在引物 3' 末端倒数第二个碱基处引入一个额外的错配碱基,这种方法被命 名为简单等位基因辨别 PCR(simple allel-discriminating PCR,SAP),与 CAPS 相

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