简单等位基因辨别PCR

简单等位基因辨别 PCR 的基本原理是为了辨别野生型和突变型等位基因间的碱基变化，在 SAP 分析中设计的一个上游引物只与 野生型配对，另一个上游引物只与突变型配对，这两个等位基因特异的引物分别与一个下游引物进行标准的 PCR 反应。引物设计基于这样的原则：如果 SNP 错配在等位基因特性引物和非模板 的靶序列之间会导致较弱的不稳定，就在引物 3' 末端倒数第二个位点引入一个强的不稳定错配。相反，如果 SNP 错配已有很强的不稳定效应，就应当在倒数第二个位置引入一个较弱的不稳定错配。如果在 SNP 错配处存在中等强度的不稳定效应，就在倒数第二个位置引入一个较弱或中等强度的错配。

设计等位基因特异性引物时，在引物 3' 末端倒数第二个位置引进的碱基应当根据表 14-2 来决定。图 14-4 (a) 说明了检测 seu-1 基因突变体引物设计的步骤。在这个例子中，末端错配是弱不稳 定的 (G-T，A-C)，因此在引物 3'末端倒数第二个位置引入强不稳定错配 (G-A)。在图 14-4 (b) 中，假设基因由 C 突变为 A, 由于末端错配 (G-A 和 T-C) 是强不稳定的，从而在倒数第二个位置 引入一个弱不稳定的错配 (T-G)，① 显示了 WT 引物与 WT 模板正确的配对，PCR 能够进行：② 显示了 MT 引物与 MT 模板稳定的配对，PCR 正常进行；③ WT 引物与 MT 模板的不稳定配对，由于连续两个错配，PCR 不能进行；④ 引物与 WT 模板的不稳定配对，PCR 不能进行。