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限制性片段长度多态性PCR

实验分类:

PCR 技术

别名:

PCR-RFLP

最新修订时间:

简介

限制性片段长度多态性 PCR,是理论依据是首先利用 PCR 扩增目的基因,然后用限制性内切酶酶解样品 DNA,产生大量的限制性酶切片断。将限制性酶切产物进行含有漠化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离,在紫外灯下即可分辨各种限制性片段的大小及其位置。或者将限制性酶切产物与探针杂交进行放射自显影,从而区分各种片段。由于目标 DNA 之间存在有同源性和变异性,当用同一种限制性内切酶酶解不同品种或同一品种的不同个体时,不同酶切产物中就会含有相同或不同的长度片段,从而解读出目标样品之间在 DNA 分子水平的实际差异。目前,用于限制性片段长度多态性 PCR 的方法主要有 1 种:限制性片段长度多态性 PCR。

原理

限制性片段长度多态性 PCR 的基本原理,首先利用 PCR 扩增目的基因,然后用限制性 内切酶酶解样品 DNA,产生大量的限制性酶切片断。将限制性酶切产物进行含有漠化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离,在紫外灯下即可分辨各种限制性片段的大小及其位置。或者将限制性酶切产物与探针杂交进行放射自显影,从而区分各种片段。由于目标 DNA 之间存在有同源性和变异性,当用同一种限制性内切酶酶解不同品种或同一品种的不同个体时,不同酶切产物中就会含有相同或不同的长度片段,从而解读出目标样品之间在 DNA 分子水平的实际差异。

应用

限制性片段长度多态性 PCR 的常用应用领域如下:

1. PCR-RFLP 在生物分类学中的应用

生物体死亡之后,其 DNA 被释放到自然环境中。由于自然环境的演化过程能沉积和保留一定数量的这类物质,如湖泊的沉积物、琥珀等,就有可能快速扩增得到期望的目的基因或 DNA 片段,并运用 PCR-RFLP 技术对生物的遗传物质进行分析,从而了解生物的进化过程。Carl Woese 等通过比较核糖体 RNA 序列之间的差异,建立起以分子顺序为基础的种系发生树。此方法能将所有的生物联系起来,并重建生物进化的历史过程。

对沉积于环境中的微生物进行分离和培养是研究微生物圈和微生物多样性的难题之一,传统的方法很难解决这一难题。使用 PCR-RFLP 技术对 16 S rRNA、18 S rRNA 或 5 S rRNA 等基因进行扩增和分析,就能很好地研究环境样品中微生物群落和微生物的多样性。如 Lim 等对蕈状支原体和植原体的 16 S rDNA 序列分析得出它们的同源性为 72%,说明支原体和植原体在进化上存在较高的亲缘关系,但可能由于某种原因,在进化过程中使得支原体和植原体在寄主特异性和培养特性显出多样性。研究结果提示,在目前植原体尚不能人工培养的情况下,可借鉴支原体的人工培养方法,进行植原体的代谢研究及人工介质培养的选择。

不同种生物之间存在差异,同一种生物群体内个体之间也存在差异。生物群体中个体间差异的产生,一方面由于营养、气候和疾病等造成,另一方面主要是由于遗传因素而引起。若单纯以表型分类,不能区分同一种生物的单个性状、单个基因、甚至单个碱基之间的差异,借助 PCR-RFLP 技术就可以对这种差异进行研究。

2. PCR-RFLP 在研究人类遗传学疾病上的应用

某些人类的遗传性疾病是因为某一基因的碱基序列中发生突变,使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别序列。通过 PCR-RFLP 技术,用限制性内切酶酶切病人的基因,所得到的多态性段就可以帮助我们从基因水平进行疾病分析。如血友病甲是一种常见的出血性疾病,患者体内缺乏一种血液凝固初期所必需的凝血因子 (FV Ⅲ),FV Ⅲ缺陷的方式有多种,其中一种是由于基因第 14 个外显子的第 336 位氨基酸的编码基因发生突变,使 CGC 突变成 TGC,导致半胱氨酸替代了精氨酸,并同时产生了一个新的 PstI 酶切位点。这个位点的突变导致 FV Ⅲ的功能丧失。由于该突变不会影响蛋白的正常合成,它的抗原-抗体反应检测显示正常,因此无法通过抗原-抗体反应准确诊断该疾病。而采用 PCR-RFLP 或 PCR-RIPA 的分析方法不但可以对患者进行疾病诊断,还可以对胚胎早期做出诊断,这样就可以根据情况来采取措施,如终止妊娠,以达到优生优育。

另外,PCR-RFLP 也可直接作为基因分型。例如 HLA 的基因分型,可用于器官的移植和免疫学。

来源:丁香实验团队

操作方法

限制性片段长度多态性PCR

限制性片段长度多态性 PCR,是理论依据是首先利用 PCR 扩增目的基因,然后用限制性内切酶酶解样品 DNA,产生大量的限制性酶切片断。将限制性酶切产物进行含有漠化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离,在紫外灯下即可分辨各种限制性片段的大小及其位置。或者将限制性酶切产物与探针杂交进行放射自显影,从而区分各种片段。由于目标 DNA 之间存在有同源性和变异性,当用同一种限制性内切酶酶解不同品种或同一品种的不同个体

限制性片段长度多态性 PCR

一、PCR扩增1.配制 PCR 反应体系,分为单酶切单一 DNA 样本和多酶切多个 DNA 样本(1)单酶切单一 DNA 样本:以 20uL 终体系为例,将各组分混合于 200uL 的 PCR 离心管内,使各组分终浓度如下(冰上操作):1xPCR 缓冲液,0.2mM dNTP 溶液,上下游引物各1uM,1 U Taq聚合酶,10-50ng DNA,加 ddH2O 补足至 20uL; (2)多酶切多

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