基于 PCR 的大片段 DNA 的合成实验
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简介
DNA 序列的化学合成为基因在异源系统中的高水平表达和功能研究提供了强有力的工具。近年来，已经发展了许多 DNA 序列的合成和收集的方法。
早期的方法主要是酶的连接和 FokI 方法，后来自身引发 PCR、PCR 集合和模板定向连接技术发展了起来，最近又报道了长 DNA 序列的合成和收集方法，其中典型方法有基于 PCR 热力学平衡的翻转方法 (thermodynamically balanced inside-out, TBIO), 双重不对称的 PCR (dual asymmetrical, DA-PCR) 和重叠序列延伸 PCR (overlap-extension, OE-PCR) 连续 PCR 的两步基因合成法等。
目前，用于大片段 DNA 的 PCR 合成的方法主要有 1 种：基于 PCR 的长 DNA 序列准确合成法。
原理
基于 PCR 的长 DNA 序列准确合成法的基本原理是。根据目的 DNA 序列，设计并化学合成与相邻的核苷酸有 21 bp 重叠的长 60 bp 的寡核苷酸。为了降低化学合成中的错误，所有的寡核苷酸应该用 PAGE 进行纯化。一组 12 个彼此相邻的 60 bp 的寡核苷酸通过 PCR 合成 400~500 bp 长度的 DNA 片段 [图 6-5 (a)]; 大多数的 5' 正向寡核苷酸和 3' 反向寡核苷酸 (外部寡核苷酸) 以保留的 10 个内部寡核背酸作为模板，采用高保真的 DNA 聚合酶 (比如 Pfu, 每 1000 bp 小于 1 个错误)。
由于这 2 个外部寡核苷酸的浓度是内部寡核苷酸的 20 倍，大多数的 PCR 产物应该是大约 400~500 bp 的 DNA 片段。第二步 PCR 时，应用第一步 PCR 合成的所有 400~500 bp 的 DNA 片段作为模板，合成全长 DNA 序列 [图 6-5(b)]。在这步 PCR 中，应该使用产生长的准确的 DNA 片段的 DNA 聚合酶 (例如，焦硼酸钠 DNA 聚合酶，能够合成达到 10 kb 长的片段，具有与 Pfu 相似的低错误率)。最后，通过 DNA 序列分析鉴定合成的基因序列，用重叠延伸 PCR 技术校正序列中的误差。
来源：丁香实验团队
操作方法
基于 PCR 的长 DNA 序列准确合成的方法（PCR-based accurate synthesis， PAS）相对简便（只需要 2 步 PCR）、快速、准确（每合成 1 000 bp 错配 ≤ 1）和廉价，已经成功合成了大量的基因，包括含高（G + C）含量、重复序列和复杂的二级结构的基因。Xiong 等人应用 PAS 法合成了枯草芽弛杆菌次次操纵子的一个 12 kb 的 DNA 片段。运用
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