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同源一步荧光等位基因特异性PCR

实验分类:

PCR 技术

别名:

homogeneous and one-step fluorescent allele-specific PCR

最新修订时间:

简介

同源一步荧光等位基因特异性 PCR,是利用含有大量吸收单元的水溶性共轭聚电解质(water-soluble conjugated polyelectrolytes,CP),激发能量沿着 CP 的骨架转移到发色团报告物,导致荧光信 号的扩增。将等位基因特异性 PCR 与利用 CP 检测联合起来。目前,用于同源一步荧光等位基因特异性 PCR 的方法主要有 1 种:同源一步荧光等位基因特异性 PCR。

原理

同源一步荧光等位基因特异性 PCR 的基本原理同等位基因特异性 PCR 一样,同样需要三条引物,分别针对不同等位基因的两条上游引物、一条共同的下游引物,不同之处在于检测方法。在图 14-6 中,阳离子多聚物 PFP[9,9-bis(6-N,N,N-trimethylammoni-um)hexyl fluorenylene-phenylene dibromide]在荧光共振能量转移检测系统(fluorescence res-onance energy transfer,FRET)实验中用作共跑聚电解质,荧光素标记的 dGTP 和 dUTP 作为受者,PFP 作为荧光素的供者,以满足对于 FRET 的要求。含有 G 等位基因的靶 DNA 序列作为模板,在图 14-6 的情况 A 中上游引物 3' 含有与 G 配对的 C,引物与模板配对很好,PCR 反应正常进行。

在 Taq DNA 聚合酶存在下,链延伸时 dGTP-F1 和 dUTP-Fl 掺入到 DNA 链中。经过指数扩增后,得到大量的荧光素标记的扩增产物。一旦加上含有阳离子的 PFP,DNA 与 PFP 之间的强静电相互作用使得荧光素靠近 PFP,PFP 与荧光素发生了有效的 FRET。在情况 B 中,上游引物的 3' 端是与等位基因 C 配对的,与等位基因 G 并不互补,在热循环过程中,只有反向引物延伸引起的线性扩增,产生较弱的荧光素标记的 PCR 产物,在加入 PFP 之后,发生无效的 FRET。通过引发 PFP 和荧光素的发射密度的变化,就可能分析 SNP 的基因型。

来源:丁香实验团队

操作方法

同源一步荧光等位基因特异性PCR

同源一步荧光等位基因特异性 PCR,是利用含有大量吸收单元的水溶性共轭聚电解质(water-soluble conjugated polyelectrolytes,CP),激发能量沿着 CP 的骨架转移到发色团报告物,导致荧光信 号的扩增。将等位基因特异性 PCR 与利用 CP 检测联合起来。

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