同源一步荧光等位基因特异性PCR

同源一步荧光等位基因特异性 PCR 的基本原理同等位基因特异性 PCR 一样，同样需要三条引物，分别针对不同等位基因的两条上游引物、一条共同的下游引物，不同之处在于检测方法。在图 14-6 中，阳离子多聚物 PFP［9，9-bis（6-N，N，N-trimethylammoni-um）hexyl fluorenylene-phenylene dibromide］在荧光共振能量转移检测系统（fluorescence res-onance energy transfer，FRET）实验中用作共跑聚电解质，荧光素标记的 dGTP 和 dUTP 作为受者，PFP 作为荧光素的供者，以满足对于 FRET 的要求。含有 G 等位基因的靶 DNA 序列作为模板，在图 14-6 的情况 A 中上游引物 3' 含有与 G 配对的 C，引物与模板配对很好，PCR 反应正常进行。

在 Taq DNA 聚合酶存在下，链延伸时 dGTP-F1 和 dUTP-Fl 掺入到 DNA 链中。经过指数扩增后，得到大量的荧光素标记的扩增产物。一旦加上含有阳离子的 PFP，DNA 与 PFP 之间的强静电相互作用使得荧光素靠近 PFP，PFP 与荧光素发生了有效的 FRET。在情况 B 中，上游引物的 3' 端是与等位基因 C 配对的，与等位基因 G 并不互补，在热循环过程中，只有反向引物延伸引起的线性扩增，产生较弱的荧光素标记的 PCR 产物，在加入 PFP 之后，发生无效的 FRET。通过引发 PFP 和荧光素的发射密度的变化，就可能分析 SNP 的基因型。