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同源一步荧光等位基因特异性PCR

相关实验:同源一步荧光等位基因特异性PCR

别名:homogeneous and one-step fluorescent allele-specific PCR

最新修订时间:

简介

同源一步荧光等位基因特异性 PCR,是利用含有大量吸收单元的水溶性共轭聚电解质(water-soluble conjugated polyelectrolytes,CP),激发能量沿着 CP 的骨架转移到发色团报告物,导致荧光信 号的扩增。将等位基因特异性 PCR 与利用 CP 检测联合起来。

原理

同源一步荧光等位基因特异性 PCR 的基本原理同等位基因特异性 PCR 一样,同样需要三条引物,分别针对不同等位基因的两条上游引物、一条共同的下游引物,不同之处在于检测方法。在图 14-6 中,阳离子多聚物 PFP[9,9-bis(6-N,N,N-trimethylammoni-um)hexyl fluorenylene-phenylene dibromide]在荧光共振能量转移检测系统(fluorescence res-onance energy transfer,FRET)实验中用作共跑聚电解质,荧光素标记的 dGTP 和 dUTP 作为受者,PFP 作为荧光素的供者,以满足对于 FRET 的要求。含有 G 等位基因的靶 DNA 序列作为模板,在图 14-6 的情况 A 中上游引物 3' 含有与 G 配对的 C,引物与模板配对很好,PCR 反应正常进行。

在 Taq DNA 聚合酶存在下,链延伸时 dGTP-F1 和 dUTP-Fl 掺入到 DNA 链中。经过指数扩增后,得到大量的荧光素标记的扩增产物。一旦加上含有阳离子的 PFP,DNA 与 PFP 之间的强静电相互作用使得荧光素靠近 PFP,PFP 与荧光素发生了有效的 FRET。在情况 B 中,上游引物的 3' 端是与等位基因 C 配对的,与等位基因 G 并不互补,在热循环过程中,只有反向引物延伸引起的线性扩增,产生较弱的荧光素标记的 PCR 产物,在加入 PFP 之后,发生无效的 FRET。通过引发 PFP 和荧光素的发射密度的变化,就可能分析 SNP 的基因型。

材料与仪器

器材:PCR 扩增仪、荧光分光光度计(Hitachi F-4500)。

试剂:

① 模板:基因组 DNA;

② dNTP 混合液:每种脱氧核糖核昔酸的浓度为 2.5 mmol/L;

③ 三条特异引物:浓度均为 10 μmol/L;

④ Tag DNA 聚合酶及 10 × PCR 缓冲液:15 mmol/L MgCl2,500 mmol/L KCI,100 mmol/L Tris-Cl,0.1%(体积分数)Triton X-100;

⑤ 虾碱性磷酸酶(Shrimp alkaline phosphatase,Takara);

⑥ dGTP-Fl(Perkin Eime),dUTP~Fl(Fermentas),PFP,SYBR gold(Invitrogen);

⑦ 高压灭菌去离子水;

⑧ 用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳仪(DYCZ-24D,北京六一)及相关试剂。

步骤

同源一步荧光等位基因特异性 PCR 的基本过程可分为如下几步:

1. 模板

利用试剂盒提取的基因组 DNA。

2. 引物设计

引物设计方法见等位基因特异性 PCR。

3. 操作方法

(1) 设立 20 μl 的 PCR 反应体系至少配制两管反应液,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入以下成分。

(2)设置 PCR 反应条件

(3)PCR 产物的检测:将 PCR 扩增产物在 15% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测,缓冲液为 1 × TBE, 电泳之后,用溶于 1 × TBE 缓冲液的 1 × SYBR Gold 染色 30 min 后,观察照相。

在荧光检测中,向 PCR 产物中加入 4 μl 虾碱性磷酸酶(0.5 U/μl),于 37 ℃ 孵育 20 min 以降解未反应的 dNTP-Fl。孵育之后,混合物置于 4 ℃,用 HEPES 缓冲液(25 mmol/L,pH8.0)稀释此混合物后,加入 PFP,使用 3 ml 石英小杯在激发波长为 380 nm 处检测发射光谱,狭缝宽度和 PMT 电压分别是 5 nm 和 700 V。

注意事项

① PCR 反应的相关注意事项见等位基因特异性 PCR,二者的操作原理一样,因此注意事项也相同。

② 在荧光检测部分,选择合适的 PFP 是至关重要的,不同的 PFP 激发的荧光强度不同,需 要进行预实验摸索条件。

来源:丁香实验

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