低温变性共扩增PCR

低温变性共扩增 PCR 的基本原理是，双链 DNA 合成时，由于单个核苷酸的错配，使得这段序列的熔点温度会产生微小的而可预测的变化。根据这段序列的上下游碱基背景和错配位置，多至 200 bp 的序列的熔点温度一般可以变化 0.2~1.5 ℃ 甚至更高。

每条 DNA 序列都有低于其熔点的临界变性温度（Tc），一旦低于这个温度时 PCR 的效率将急剧下降。例如，一条长 167 bp 的 p53 序列，当变性温度设定在 87 ℃ 时，PCR 扩增的量非常可观；当变性温度设定在 86.5 ℃ 时，PCR 扩增有适量产物；而当变性温度设定在 86 ℃ 或者更低时，就检测不到 PCR 产物了。因此这段序列的 Tc ≈ 86.5 ℃。

变性温度的临界点很大程度上取决于 DNA 的序列。当 PCR 变性温度设定在临界点时，由于单个碱基的不同，重复循环扩增时，导致不同的 DNA 有不同效率的扩增产物。在给定的序列的任何位置存在一个或者多个不一样的碱基，选择性扩增少数等位基因时，就能够观察到这种现象了。在 COLD-PCR 中，为了使突变型基因和野生型的等位基因发生分子杂交，PCR 循环时中间需要设定一个退火温度，异型双链杂交时的退火温度要低于同型双链，因此扩增时异型双链在 T_c 时已经变性，而同型双链仍是双链的状态将无法高效扩增。COLD-PCR 时通过将变性温度设定在 T_c，突变子在任何位置都能大量得到扩增。

根据实验的需要，COLD-PCR 分为两种应用模式，即完全 COLD-PCR 和快速 COLD-PCR, 前者侧重于鉴别出所有可能的突变子，后者侧重于大量得到低变性温度的突变子。

(1) 完全 COLD-PCR: 图 14-7(a)］ 首先经过数个常规 PCR 循环，使得原始目的扩增子得到积累，然后启用完全 COLD-PCR 程序。94 ℃ 变性后，PCR 扩增子在中间退火温度进行杂交（70 ℃ 条件下，2~8 min）。由于含有突变基因的突变体数量很少，绝大多数的突变体等位基因因两条链碱基的不能完全互补配对而终止于异源双链的状态，异源双链熔点温度要低于完全配对结构（同源双链）。然后 PCR 体系的温度升至 T_c 使得异型双链变性，而同型双链未能变性，最后体系温度降至 55 ℃, 使得引物与优先变性的模板结合，为下一轮复制作准备。因为每一轮 PCR 都执行临界变性温度，使得含突变子的等位基因的扩增的量呈指数增长，循环到最后各个突变子基因和野生型等位基因的扩增效率就相差很大了。

（2）快速 COLD-PCR［图 147(b)］ 通过 COLD-PCR 使低变性温度的突变子基因扩增的方式如下所述，大多数点突变基因即使没有中间 70 ℃ 的杂交环节，也能得到扩增，因此快速 PCR 扩增是在专门为低熔点等位基因设置的 T_c 下进行的，而不是 94 ℃。例如，现在两个等位基因仅有一对碱基不同，A：T 置换了 G：C， 在循环过程中，等位基因 A：T 突变子得到扩增，因为所含的碱基对 A：T 复制子的熔点温度要低于等位基因 G：C。对于突变子的扩增，完全 COLD-PCR 需要大量的 PCR 产物累计来获得高效的分子杂交，这就限制了 PCR 后阶段的扩增。不同的是，快速 COLD-PCR 无需 PCR 产物的积累，所以突变子在早期的循环中就能得到扩增。快速 COLD-PCR 的扩增速度要比完全 COLD-PCR 快，扩增的量也较多。然而，要扩增出所有可能的突变子，包括缺失性突变和插入型突变，完全 COLD-PCR 程序还是不可或缺的。在完全 COLD-PCR 时, 经常会出现突变子与野生型序列之间的错配，而且不管突变的核昔酸增加或降低其熔点温度，都会有扩增产物。