​从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因组DNA

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悬浮培养细胞
PBS 裂解液 100%硫酸二甲酯（DMS) 100%乙醇 室温
50 mL螺口聚丙烯管（如Coming公司产品） 台式离心机

1) 在50 mL螺口聚丙烯管中分别准备3份49 mL PBS,用前置于冰上预冷至少30 min。配制裂解液并且在15 mL螺口聚丙烯管中准备3份2.7 mL裂解液。

2) 将2份含有0.5×10⁸〜1×l0⁸细胞的培养液转移至50 mL聚丙烯管中，在台式离心 机上室温500 g (在IEC Centra-7R离心机上为1500r/min)离心5 min,吸出并弃上清。留下足以将细胞重悬至1 mL终体积的培养液，用手指弹击管底部，或用移液器轻轻地上下抽吸以重悬细胞。

3) 对于对照（未处理的）悬浮细胞：将1 mL重悬细胞加入1份49 mL冰冷的PBS溶液中，轻轻颠倒以充分混合，于4℃ 500 g离心5 min，然后进行步骤8。

4) 对于DMS处理悬浮细胞：将1 mL重悬细胞转移到L 5 mL微量离心管中，然后在通风橱中的37℃水浴中保温。

5) 将10μL室温100% DMS加入到90μL100%乙醇制备10%的DMS溶液。在涡旋混 合器上振荡25 s以充分混匀，稍加离心，收集液滴。10%的DMS用乙醇配制是由于该浓度的DMS不溶于水。

6) 加入10μL 10%的DMS溶液于保温的细胞中，轻轻颠倒以混匀，37℃温育1 min。 立即将细胞加入到冰冷的1份49 mL PBS溶液中，轻轻颠倒以混匀，于4℃500 g离心 5 min。此处所列出的DMS的用量及温育时间，适用于作为预备试验的出发条件，为得到最佳的DMS足迹，可能有必要对它们进行修正。

7) 吸出并弃上清。然后从第3份冰冷的PBS溶液中取1〜5 mL将细胞迅速重悬，立即加入冰冷的PBS到50 mL管中，轻轻颠倒以混合。在4℃ 500 g离心5 min。

8) 对于对照细胞和处理细胞：吸出并弃上清。细胞重悬于300μL冰冷的PBS，然后转移到独立的每份2.7 mL的裂解液中，轻轻颠倒以混合。继续DNA提取步骤，并进行对照DNA的DMS处理及哌啶断裂

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