用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR实验

PCR 技术

最新修订时间：2022-02-10

简介

PCR可用以指数扩增位于两个特定引物杂交位点之间的DNA片段，而在连接介导的单侧PCR中，本质上，它只需要一个引物杂交位点的特异性，第二个引物是通过连接反应加上的单一接头。这个接头和旁侧的基因特异性引物一起可以对任何DNA片段进行指数级的扩增。由于一个确定的已知长度的序.列被加于每个片段，可以完整地扩增一些复杂的DNA群体，如分辨率达到单碱基水平的序列梯。来源：《精编分子生物学实验指南》第五版

来源：丁香实验

操作方法

连接介导的单侧PCR

1) 将5μL (2μg)打断的基因组DNA加入到一个硅化的1.5 mL微量离心管中，冰水浴放置数分钟。剪切的DNA样品必须干净，如果DNA中混有其他污染物（如哌啶）将干扰反应。从6×105个基因组（3×1O5个双倍体细胞核）出发可得到高质量、重复性好的足迹分析及测序反应。这相当于2μg小鼠（哺乳动物）基因组DNA。对于其他的物种，一般单倍体基因组数至少为6 ×105,但是不同的基因组大小会导致相

从单层细胞制备用于DMS足迹分析的基因组DNA

1) 在实验前先准备好以下溶液：在置于通风橱的37℃水浴中预热的PBS(约75 mL/ 15 cm培养皿）；将每份24 mL细胞培养液加入到50 mL的一次性使用螺口聚丙烯管中，与PBS—样在37℃水浴预热。配制裂解液。2) 对于对照（未处理的）细胞：弃去15 cm组织培养皿中的培养液，迅速加入约25 mL 预热的PBS，轻轻晃动几次，倒掉PBS。立即进行步骤5。3) 对于体内DMS处理细胞：弃去

从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因组DNA

1) 在50 mL螺口聚丙烯管中分别准备3份49 mL PBS,用前置于冰上预冷至少30 min。配制裂解液并且在15 mL螺口聚丙烯管中准备3份2.7 mL裂解液。2) 将2份含有0.5×108〜1×l08细胞的培养液转移至50 mL聚丙烯管中，在台式离心机上室温500 g (在IEC Centra-7R离心机上为1500r/min)离心5 min,吸出并弃上清。留下足以将细胞重悬至1 mL终