PCR用于进化分析
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图2用NS1和NS2作引物的核小亚基rRNA基因片段的扩增结果。除退火温度为45℃ 外,扩增反应条件、电泳及溴化乙啶染色观察方法见《实验方法》一节中所述。 1.Laccariabicolor一种菌根担子菌,2.Alderglutinosa,3.果蝇(Drosophilamel anogaster)4.Anelosimusexinius,一种蜘蛛,5.Tyromycesunicolor,一种担子菌 rDNA 重复单元的克隆质粒DNA 。6.不含DNA 的阴性对照7.空格8.标准分子量参照物(P hiX174RFHaeⅢ) TGLFLAMHYSPDASTAFSSIAHITR25 HumanACAGGACTATTCCTAGCCATGCACTACTCACCAGACGCCTCAACCGCCTTTTCATCA ATCGCCCACATCACTCGA75 sheepACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCTGACACAACAACAGCATTCTCCTCT GTAACCCACATTTGCCGA75 ChickenACCGGCCTAGTACTAGCCATGCACTACACAGCAGACACATCCCTAGCCTTCTCCT CCGTAGCCCACACTTGCCGG75 saiamanderACAGGGTTATTTTTAGCTATACATTATACAGCAGATACATCATCAGCATTCT CATCCGTAGCCCACATTTGCCGA75 FishACAGGCCTTTTCCTAGCCATACACTATACCTCCGACATCGCCACCGCCTTTTCCTCCG TCGCCCACATCTGTCGT75
DVNYGWIIRYLHANGASMFFICLFL50 HumanGACGTAAATTATGGCTGAATCATCCGCTACCTTCACGCCAATGGCGCCTCAATATT CTTTATCTGCCTCTTCCTA150 SheepGACGTAAACTATGGCTGAATTATCCGATAAATACACGCAAACGGGGCATCAATATT TTTTATCTGCCTATTTATG150 ChickenAACGTACAATACGGCTGACTCATCCGGAATCTCCACGCAAACGGCGCCTCATTC TTCTTCATCTGTATCTTCCTT150 SalamanderGATGTAAATTATGGTTGACTTATACGAAATATTCACGCAAACGGCGCTTCA TTCTTTTTTATTATTATCTTTCTT150 FishGACGACGTCAACTACGGTTGACTCATCCGAAATATGCACGCCAACGGCGCATCCTTC CTCTTCATTTGTATTTAC150
HIGRGLYYGSFLYSETWNIGIILLL75 HumanCACATCGGGCGAGGCCTATATTACGGATCATTTCTCTACTCAGAAACCTGAAACA TCGGGATTATCCTCCTGCTT225 SheepCATGTAGGACGAGGCCTATACTATGGATCATATACGTTCCTAGAAACATGAAACAT TGGAGTAATCCTCCTATTC225 ChickenCACATCGGACGAGGCCTATACTACGGCTCATATATGTTCAAAGAAACATGAAAC ATTGGAGTAATTTTATTATTT225 SalamanderCATATTGGTCGAGGAATATATTACGGCTCATATATGTTCAAAGAAACATGA AACATTGGAGTAATTTTATTATTT225 FishCACATTGGCCGAGGGTTATACTATGGCTCCTATTTATATAAAGAAACCTGAAATATT GGAGTTATCCTCCTCCTT225 图3五种脊椎动物的细胞色素b的部分序列。如《实验方法》一节所述用引物 L14841和Hl5149的扩增。氨基酸序列是人类mt DNA 的翻译产物。其它序列分别是羊(绵羊,Ovisaries)、鸡(原鸡, Gullusgullus)、蝾螈(Ambystomatigrinum)和丽鱼(Julidochromisregani)的。 用错配引物进行的扩增 PRIMER Fish5'-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3' TEMPLATE Human..................c.............. Cow...........A.........T.....T..... Mouse............T.......T.......... 图4.用错配引物进行的扩增。显示细胞色素b引物Ll4841的部分序列。尽管在引 物中部有几处错配,但它能用来扩增各种哺乳动物的模板。3'末端与模板配对完好是绝对重要的。 讨论 从任何一种生物 的几个DNA 分子上迅速扩增序列的技术在进化及生态学研究中有 多种用途。在此我们讨论此技术发展的前景及其在这些领域中的其它应用。 分子分类学 虽然用核酸序列数据进行分类研究的优点早已被承认,但序列比较数据的积累过 程都是繁琐的。PCR/?通用引物技术所提供的快速测序法促使分子分类学的范围扩展 到更多的类群。由序列中得出的均一数据为各种类群的生物 提供了一个共同的系统发 育框图。序列数据同样也提供了过去的方法所不能提供的分辨率。线粒体DNA 的扩增 和直接测序也已用地获得序列来证明在关于人类的mtDNA 家系图中非洲人是其基础。 在另一项研究中,对灵长类型组织相容性基因的系统发育分析表明HLA-DQα基因座的 许多等位基因的起源早于人类的发生。 因为只需要有靶序列几个分子扩增就可以完成,许多以前很难进行分子分析的样 品都可以使用。可以用博物馆保存的及植物标本室中的标本进行工作促进了分子数据 在各种分类研究中的应用。这些技术在古代标本上的应用也是令人兴奋的。在佛罗里 达泥炭沼中保存了7000年的脑DNA 中发现其含有一个在现存土蓍美洲人中不存在的新 型mtDNA 。 种群生物 学 序列的快速扩增使在DNA 序列水平上进行大量的种群研究成为可能。单链扩增对 几十或十百个个体进行快速测序而不经过以前所需的繁琐的克隆步骤。一旦得到了一 组具代表性的序列数据,可用更方便而简单的分析方法,如用等位基因寡聚核苷酸探 针(见16章)来获得等位基因的序列数据。 对博物馆标本进行测序的工作使对过时的基因序列的研究变得更容易了。Thomas 及助手通过保存标本的皮肤mtDNA 扩增研究了70年内的一系列啮齿动物类群。直至今 日用现代分子技术分析在如此长的一段时间基因序列的变异才成为可能。 生态及海洋生物 学 对分析来说,传统分子技术所需的组织样品用量相对较多。尤其是许多无脊椎动 物,它们对于进行分子检测所用的一般操作方法来讲太小。因此,对于小生物 、共生 生物 或那些在培养基中不易生长的生物 个体的直接分析是困难。聚合酶链反应有和来 扩大能进行分子检测的生物 范围。现在可以直接研究象原生物 和藻类等单细胞生物 自 然种群的基因结构。此方法在生物 的分布及数量分析中会有广泛的应用,尤其是用于 海洋环境中的生物 。最后,聚合酶链反应的敏感性使其可以检出及鉴定少量的单细胞 生物 、共生生物 及寄生生物 ,既使样品是来自后二者宿主的DNA 混合物中也可检出。 无损伤样品检验 用于基因分析的样品一般都需要采血样或取组织。这就限制了基因分析在行为学 及生态学研究中的应用,在这些领域中必须把对象所受的干扰减到最低。从诸如单根 头发等法医学样品中扩增序列为行为科学家及保留生物 学家提供了一个新机会。无损 伤样品检验也使收集用于研究的危险生物 的样品变得容易。 分子研究和生物 体研究的协同 通过分子分析所开辟的物种研究新领域,我们希望在分子生物 学家及种群生物 学 家之间建立大量的相互合作。例如为系统发育的重建所收集的比较序列可清楚地显示 出蛋白质的结构及作用。通常不在实验室里进行的,对适应独特环境的生物 体的分子 研究可能会揭示独物的分子适应性变化。相反,对遗传变异体的分子结构的了解也有 助于我们了解生物 体是如何进化的。 >
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